نشكر تشاندران Sabanayagam لمساعدته في تطوير النظام ، جوشوا إيديل للحصول على المشورة بشأن تصميم الجهاز ميكروفلويديك والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد لقطع الآلات من الإعداد. نعترف مناقشات مفيدة مع أعضاء مجموعة ميلر في معهد رولاند وفي جامعة بوسطن ، وأعضاء فريق T. ها &#39;s في UIUC للحصول على معلومات مفيدة. أخيرا ، ونحن نقدر الدعم المالي من مؤسسة العلوم الوطنية (PHY - 0701207) والمعهد الوطني للصحة (GM075893).

1 -- تركيب الخلية ميكروفلويديك يرصد الخلية ميكروفلويديك بواسطة التفجير a منقوشة ، 2 مم ، polydimethylsiloxane (PDMS) القرص لزلة تغطية الكوارتز تنظيفها حديثا. PDMS القرص يحتوي على أربع غرف مستطيلة 30 ميكرولتر التي يتم الوصول إليها من خلال مدخل ومخرج الشعيرات الدموية مرنة متصلة العازلة خزان ومضخة الحقن ، على التوالي ، لتدفق تسيطر عليها العازلة. ويدعم خلية تدفق على الجانب الخلفي من خلال نافذة زجاجية وضعت على حامل الخلية مخصصة الصنع تحتوي على عنصر المياه المبردة الحرارية لتنظيم درجة الحرارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل PDMS منقوشة القرص ، مزيج 10 الاستومر سيليكون أجزاء القاعدة مع 1 جزء عامل علاج ، تخلط جيدا وتترك لمدة 1 ساعة التفريغ في فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المزيج بلطف على الاستومر القالب الخلية ميكروفلويديك. في حالتنا ، فإن هذا هو 1 رقاقة السيليكون &quot;مع أربعة شرائط (1x10 1x10 4 × 3 × 300 ميكرون) مصنوعة من مقاومة للضوء سلبية. اترك هذا لعلاج على طبق ساخن في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعناية القرص PDMS شفي من العفن باستخدام شفرة حلاقة. فتيل القرص على زجاج نافذة 1 &#39;&#39;(التي تحتوي على 8 × 2 ملم القطر قبل حفر ثقوب في كلا طرفي القنوات) بواسطة البلازما المؤكسدة كلا السطوح لمدة 30 ثانية. صهر زجاج النوافذ على الجانب المسطح من القرص PDMS (الجانب لا يحتوي على قنوات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج 2 بوصة طويلة أنابيب مرنة السيليكا تنصهر الشعرية من خلال ثقب في كل نافذة من الزجاج حتى يصل إلى القناة. قد ادخال ابرة أولا ثم التالية مع الشعرية تسهيل هذه العملية. اغلاق النافذة الزجاجية الثقوب باستخدام علاج سريع الصب السيليكون مركب مثل كويك الصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القنوات مع الايثانول والمياه ، والبلازما تنشيط الخلايا جنبا إلى جنب مع تنظيفها حديثا ، 1 بوصة دائرية زلة تغطية الكوارتز لمدة 30 ثانية. نقترح التنظيف باستخدام هذه زلة تغطية البيرانا *. فتيل زلة تغطية إلى جانب الخلية التي تحتوي على القنوات ، وختم الغرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلية تجميعها لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> * سمكة البيرانا هو حل من H 2 O 2 و H 2 SO 4 في 1:2.5 النسب. زلات لتنظيف الغطاء ، تزج بهم في هجوم اسماك الضاري في 90 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية. 2 -- تفعيل السطح لاستيقاف جزيء لدراسات الحمض النووي ، وتجميد سطح أبسط نظام يتكون من طلاء الزجاج لأول مرة أو زلة تغطية الكوارتز مع ألبومين المصل البقري biotinylated (BSA) ، ثم مع streptavidin. هذا يسمح يجمد العينة biotinylated مع خصوصية عالية لعدة أيام في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب مرنة إلى الشعيرات الدموية للحقن العازلة من السهل استخدام المحاقن والإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول 0.1 ملغ / مل من جيش صرب البوسنة في biotinylated العازلة A (10 ملي TRIS ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم وتصفيتها باستخدام مرشحات 0.02 ميكرون) في القناة واحتضان ما لا يقل عن 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق ميكرولتر من 300-500 ألف العازلة لإزالة أي BSA مجانا biotinylated من القناة ، والحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء داخل الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول 0.1 ملغ / مل من streptavidin العازلة في ألف واحتضان لمدة 15 دقيقة. ثم كرر الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التدفق من خلال حل 3-5 مساء من العينة biotinylated. إجراء فحص سطحي للتأكد من التغطية من الجزيئات الفلورسنت. إذا لزم الأمر ، وزيادة تركيز العينة للحصول على تغطية أفضل. احتضان لمدة 10 دقيقة ثم كرر الخطوة 3. </li></ol> هي التي شنت على الخلية ميكروفلويديك مرحلة XY بمحركات السماح الخشنة (تصل إلى 25 ملم) الحركة باستخدام ترميز بصريا العاصمة المحركات ، وغرامة (1 نانومتر) الحركة باستخدام اثنين من حلقة مغلقة المحركات بيزو (Physik الرفيعة Instrumente طراز M - 014 أو ما شابه ذلك). ويمكن القيام بذلك إما قبل أو بعد تفعيل السطح لتجميد العينة. 3 -- اعداد الاحتياطي التصوير (IB) وباء يتكون من نظام الأكسجين الأنزيمية نظافتها وفاكهه تقضي الثلاثي ، مثل Trolox. منذ يتم مسح IB بين عشية وضحاها من خلال باستمرار ، ينبغي إعداد ما لا يقل عن 10 مل مقدما. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل من 0.8 ٪ ث / ت مد الجلوكوز ، على الأقل 35 مم TRIS - 8.0 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات. ارتفاع تركيز العازلة مهم لسببين : Trolox حل سوف يحمض الحل ، وردود الفعل الأنزيمية وأيضا انخفاض الرقم الهيدروجيني من الحل مع مرور الوقت. ويمكن هذا الحل منذ مدة صلاحية طويلة يمكن تخزينها كحل الأسهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ملغ من حل Trolox في المنطقة العازلة على استعداد في الخطوة 1 من vortexing لبضع دقائق ثم 10 دقيقة ليهز&gt;. Trolox غير قابلة للذوبان في الماء جدا عند pH&gt; 7 ، لذلك لا تتعجل هذه الخطوة. مرشح الحل باستخدام ميكرومتر 0.2 التصفية وترك فراغ في التفريغ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;gloxy&quot; حل عن طريق خلط الأنزيمية 60 ميكرولتر wateص ، 20 ميكرولتر من العازلة 5X A ، 20 ميكرولتر من الكاتلاز ، 1 أوكسيديز الجلوكوز ملغ و 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل جيش صرب البوسنة. تصفية الحل باستخدام جهاز للطرد المركزي 0.22 ميكرون التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج برفق العازلة من الخطوة 2 مع الحل &quot;gloxy&quot; من الخطوة 3 تجنب تشكيل فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق IB عبر القناة بمعدل ثابت من 5 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة الحقن الميكانيكية للسيطرة على معدل التدفق. فقاعة غاز الأرجون في المكمن IB لمنع الأكسجين في الغلاف الجوي من إعادة حل في المنطقة العازلة. </li></ol> يتم التحكم في مسح السطح ، وتوطين جزيء واقتناء واحدة يتتبع كثافة الجزيء بواسطة برنامج LABVIEW التي تسمح الآلي جمع البيانات 1. البرنامج بمسح 20x20 2 ميكرومتر في المناطق القرار ميكرومتر 0.2 ، وذلك بنسبة 0.1 ميكرون / مللي. تتم معالجة البيانات على الفور إلى العائد كثافة المرجحة لجميع المواقع بكسل فوق التهم الخلفية. حالما يتم العثور على جزيئات يجمد ، فهي انتقلت تسجل واحدا تلو الآخر في حجم وكثافة مبائر من الجهات المانحة وfluorophore متقبل بوصفها وظيفة من الوقت حتى كلا photobleach fluorophores. مبرمجة ثم مرحلة للانتقال إلى أصل 100 ميكرون الجديدة بعيدا ، ويتم تكرار عملية المسح. 4 -- نتائج الممثل وفيما يلي بعض الصور التي تبين الخلية ميكروفلويديك تجميعها قبل التنشيط السطحية وبعد أن شنت على استعداد لتجميد المجهر الجزيء. إذا تم تنشيط قناة بنجاح ، يجب أن تفحص السطح تكون مشابهة لتفحص يصور أدناه تبين انبعاث الصبغة المانحة (الخضراء) ومتقبل (الأحمر) بعد الإثارة مباشرة من الجهات المانحة. يتم نقل هذه الجزيئات واحدا تلو الآخر في حجم التحقيق وسجلت مضان بمرور الوقت حتى كلا photobleach الأصباغ ، كما هو موضح في آثار جزيء واحد. ويمكن من آثار مثل هذه واحدة الحصول على الكفاءة التي يبلغ الحنق على الفصل المانحين متقبل لحظية ، والذي بدوره يستخدم لاستكشاف هيكل وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /> الشكل 1 : الخلية ميكروفلويديك مع أربع قنوات ، ولكل منها مدخل / مخرج الشعيرات الدموية. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" border="0" /> الشكل 2 : الخلية التي شنت على استعداد لإجراء قياسات المجهر. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="الشكل 3" border="0" /> الشكل 3 : الإعداد لSM - الحنق القياسات. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="الشكل 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="الشكل 5" border="0" /> أرقام 4 و 5 : قناة الأحمر والأخضر لمسح سطح جزيئات يجمد الحنق متحمس مع ليزر خضراء. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">الرقم 4</a> ، أو <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">الشكل 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="الشكل 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="الشكل 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="الشكل 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="الشكل 9" border="0" /> ارقام 6 و 7 و 8 و 9 : مسارات كثافة المانحة (الخضراء) ومتقبل (الحمراء) fluorophores المسمى لجزيء DNA 8 و 10 و 16 و 18 basepairs إربا. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">الرقم 6</a> ، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">7 الشكل</a> ، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">الرقم 8</a> ، أو <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">الشكل 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

على الرغم من أنه تم تحسين البروتوكول أعلاه لنظامنا معينة ومحددة لاختيار من الأصباغ (TMR وATTO647N) ، فإنه ليست بأي حال ثبت الأسلوب فقط. في الآونة الأخيرة ، وظهر نظام بديل الأكسجين الكسح التي تتكون من حمض protocatechuic (PCA) / ​​protocatechuate 3 ،4 - دي أكسيجيناز (PCD) لزيادة صمود للضوء من الأصباغ معينة 4. وبالمثل ، يمكن استخدام الثلاثي دولة أخرى مثل quenchers المركابتويثانول - β (BME) بدلا من Trolox ، رغم أن هذه قد لا تدوم طويلا قمع وامض بعض الأصباغ ، في 5 Cy5 معينة. على الرغم من الشلل عبر ألبومين البيوتين streptavidin - biotinylated المصل البقري (BSA) هو الخيار المفضل للدراسات الأحماض النووية ، هي مناسبة أفضل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) المغلفة السطحية للدراسات من البروتينات لأنها غير محددة يمنع التصاق 1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفرعي حيود محدودة الحجم إلى الحويصلات تغليف جزيء حيوي من الاهتمام في الحالات التي يمكن أن تتأثر بها التفاعلات السطحية 6. في هذه المقالة قد اعتدنا على إعداد مبائر مجهزة photodiodes الانهيار السيليكون للحصول على آثار كثافة مضان. هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع توتال الداخلية المجاهر الإسفار التأمل (TIRF) مجهزة بكاميرات CCD. بغض النظر عن استخدام المجهر ، SM - الحنق يمكن الابلاغ عن القرارات المكانية يقترب من انجستروم عندما يتم تصحيحها بشكل صحيح إشارة المانحة ومتقبل 7.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) تم المجهري تستخدم على نطاق واسع لدراسة بنية وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام ، مثل الأحماض النووية والبروتينات. جزيء واحد الحنق (SM - الحنق) القياسات على جزيئات يجمد تصريح طويلة من الملاحظات من قبل النظام على نحو فعال على حد سواء حتى photobleach الأصباغ ، مما يؤدي إلى آثار في الوقت الذي يقدم تقريرا عن الديناميات الجزيئية البيولوجية مع طائفة واسعة من الجداول الزمنية من الألف إلى دقائق. لتسهيل اقتناء عدد كبير من التحليلات الإحصائية للآثار ، لا بد من آلية عملية وينبغي أن تكون البيئة عينة رقابة مشددة على مدار الزمن القياس بأكمله (~ 12 ساعة). ويتم إنجاز هذا باستخدام مجهر المسح الآلي مبائر التي تسمح للاستجواب الآلاف من الجزيئات واحدة بين عشية وضحاها ، وخلية ميكروفلويديك الذي يسمح للسيطرة على تبادل العازلة ، مع تقييد محتوى الاكسجين ويحافظ على درجة حرارة ثابتة طوال فترة القياس بأكملها. هنا نبين كيفية تجميع الجهاز ميكروفلويديك وكيفية تفعيل سطحه لتجميد الحمض النووي. ثم كيف لنا أن نفسر لإعداد عازلة لتحقيق أقصى قدر من صمود للضوء وعمرها fluorophores. أخيرا ، وتبين لنا الخطوات المتبعة في إعداد برنامج الإعداد لاقتناء الآلي من الوقت حل جزيء واحد من آثار الحنق جزيئات الحمض النووي.

Watch this Scientific Journal Video about Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules at JoVE.com

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

نحن في هذه المقالة تصف كيف يمكننا الحصول على الحنق من آثار جزيئات الحمض النووي الفردية ثبتوا على السطح باستخدام المجهر الآلي مبائر المسح.

النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Boston University. نحن في هذه المقالة تصف كيف يمكننا الحصول على الحنق من آثار جزيئات الحمض النووي الفردية ثبتوا على السطح باستخدام المجهر الآلي مبائر المسح.

Video: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

والعزلة وتصوير الأسفار لتعمير واحد-الجسيمات Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

إعادة بناء خلية واحدة توقيعات الفلورية الفطرية من قبل المجهر Confocal

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...