Damos las gracias a Chandran Sabanayagam por su ayuda en el desarrollo del sistema, Josué Edel para el asesoramiento en el diseño del dispositivo de microfluidos y el personal del Instituto Rowland en la Universidad de Harvard para el mecanizado de piezas de la instalación. Reconocemos conversaciones útiles con los miembros del grupo Meller, en el Instituto Rowland y la Universidad de Boston, y los miembros del grupo T. Ha &#39;s de la UIUC para obtener información útil. Finalmente, agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias (PHY-0701207) y el Instituto Nacional de Salud (GM075893).

1 - Montaje de las células de microfluidos La célula de microfluidos se hace mediante la fusión de un patrón, 2 mm de espesor, polidimetilsiloxano (PDMS) de disco en una hoja de cubierta de cuarzo recién limpiado. El disco contiene cuatro PDMS 30 cámaras l rectangular que se accede por la entrada y salida flexibles capilares conectado a un tanque de regulación y una bomba de jeringa, respectivamente, para el control de flujo de buffer. La celda de flujo es compatible con su parte trasera por una ventana de vidrio y colocado en un soporte de la celda a medida que contiene un elemento termoeléctrico refrigerado por agua para regular la temperatura. <ol><li> Para hacer que el patrón PDMS disco, mezcla de 10 partes de base de elastómero de silicona con un agente de curado parte, mezclar bien y dejar de desgasificación durante 1 hora en el vacío. </li><li> Suavemente vierta la mezcla en el molde elastómero de células de microfluidos. En nuestro caso, se trata de una una &quot;oblea de silicio con cuatro tiras (1x10 1x10 4 x 3 x 300 m) a partir de fotosensible negativa. Deje esta para curar en un plato caliente a 70 ° C durante dos horas. </li><li> Retire con cuidado el disco curado PDMS del molde con una cuchilla de afeitar. Fundir el disco en una ventana de vidrio de 1&#39;&#39;(que contiene 8 x 2 mm de diámetro los agujeros previamente perforados en ambos extremos de los canales) por plasma oxidante ambas superficies durante 30 segundos. Fusionar las ventanas de cristal en el lado plano del disco PDMS (el lado que no contengan los canales). </li><li> Inserte una de 2 pulgadas de largo tubo flexible capilar de sílice fundida a través del agujero de cada ventana de vidrio, hasta que llegue al canal. Inserción de una aguja y luego sigue con el capilar puede facilitar este proceso. Selle los orificios ventana de cristal con un compuesto de curado rápido de fundición de silicona tales como Kwik-Cast. </li><li> Enjuague los canales con etanol y agua, y el plasma a activar la célula, junto con un recién limpiada, de 1 pulgada de deslizamiento circular cubierta de cuarzo de 30 segundos. Le recomendamos la limpieza de esta hoja de cubierta con pirañas *. Fusionar la hoja de la cubierta al lado de la celda que contiene los canales, sellado de las cámaras. </li><li> Salir de la celda se reunieron para curar toda la noche a temperatura ambiente. </li></ol> * Piranha es una solución de H 2 O 2 y H 2 SO 4 en proporciones 1:2,5. Para limpiar la cubierta se desliza, lavarlos en pirañas a 90 ° C durante 20 min. 2 - Activación de la superficie para la inmovilización de moléculas Para los estudios de ácido nucleico, el esquema de la superficie más simple consiste en la inmovilización primera capa un vaso o una hoja de cubierta de cuarzo con biotina albúmina de suero bovino (BSA) y luego con estreptavidina. Esto permite que la muestra con biotina a ser inmovilizada con una alta especificidad para el día a temperatura ambiente. <ol><li> Conecte el tubo flexible de los capilares de inyección de tampón fácil con una jeringa y aguja. </li><li> Se inyecta una solución de 0,1 mg / ml de BSA biotina en un buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, se filtra con filtros de 0,02 micras) en el canal y se incuba durante al menos 30 minutos. </li><li> Flujo de 300 a 500 l de tampón A para eliminar cualquier BSA biotina libre de los canales, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire dentro de la cámara. </li><li> Se inyecta una solución de 0,1 mg / ml de estreptavidina en un buffer y se incuba durante 15 min. Luego repita el paso 3. </li><li> El flujo a través de una solución 5.3 pM de la muestra con biotina. Realizar una exploración de superficie para verificar la cobertura de moléculas fluorescentes. Si es necesario, aumentar la concentración de la muestra para obtener una mejor cobertura. Incubar durante 10 minutos y repita el paso 3. </li></ol> La célula de microfluidos está montado sobre una platina motorizada xy permite grueso (de hasta 25 mm) de movimiento con óptica codificada motores de corriente continua y fina (1 nm) de movimiento con dos de circuito cerrado actuadores piezoeléctricos (Physik Instrumente modelo M-014 o similar). Esto se puede hacer antes o después de la activación de la superficie para la inmovilización de la muestra. 3 - Preparación de la memoria intermedia de imagen (IB) El IB se compone de un sistema de oxígeno enzimática de barrido y un extintor de triplete, como Trolox. Desde el IB pasa a través del constante durante la noche, por lo menos 10 ml deben estar preparados de antemano. <ol><li> Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glucosa, por lo menos 35 mM Tris-HCl pH 8,0 y 50 mM de NaCl en agua destilada. La mayor concentración de buffer es importante por dos razones: Trolox disolución se acidifica la solución, y la reacción enzimática, también disminuirá el pH de la solución a través del tiempo. Puesto que esta solución tiene una larga vida útil que se puede almacenar como una solución de reserva. </li><li> Disuélvanse 5 mg de Trolox en el buffer preparado en el paso 1 por agitación durante un par de minutos y luego agitar durante&gt; 10 min. Trolox no es muy soluble en agua a pH&gt; 7, por lo que no se apresure este paso. Filtrar la solución con un filtro de 0,2 micras y dejar de desgasificación al vacío durante 10 minutos. </li><li> Prepare el &quot;gloxy&quot; solución enzimática mediante la mezcla de 60 l water, 20 l de tampón 5X A, 20 l de catalasa, una glucosa oxidasa mg y 100 l de 10 mg / ml de BSA. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 micras centrífuga. </li><li> Mezclar suavemente el buffer de la etapa 2, &quot;gloxy&quot; solución desde el paso 3 para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> El flujo de la IB a través del canal a una velocidad constante de 5 l / min utilizando una bomba de inyección mecánica para controlar el caudal. Burbuja de gas argón en el depósito de IB para evitar que el oxígeno del aire se vuelva a disolver en el buffer. </li></ol> La exploración de la superficie, localización de la molécula y la adquisición de una sola molécula de huellas intensidad es controlada por un programa de LabView que permite la recopilación de datos automatizados 1. El programa escanea 20x20 m 2 zonas con una resolución de 0,2 micras, con una tasa de 0,1 m / ms. Los datos son procesados ​​inmediatamente para obtener la intensidad ponderada por la ubicación de todos los píxeles por encima de los recuentos de fondo. Una vez que las moléculas se encuentran inmovilizados, se mueven el uno por uno en el volumen confocal y las intensidades de los donantes y fluoróforo aceptor se registran como una función del tiempo hasta que ambos photobleach fluoróforos. El estadio está programado para pasar a un nuevo origen 100 m de distancia, y el proceso de exploración se repite. 4 - Resultados de la Representante A continuación se muestran algunas imágenes que muestran las células de microfluidos montado antes de la activación de superficie y después de ser montado en el microscopio listo para la inmovilización de moléculas. Si el canal se activa con éxito, escanea la superficie debe ser similar a los escáneres se muestra a continuación muestra las emisiones de los donantes colorante (verde) y receptor (rojo) después de la excitación directa de los donantes. Estas moléculas se mueven de uno en uno en el volumen de sondeo y la fluorescencia se registra el paso del tiempo hasta que ambos photobleach colorantes, como se muestra en los rastros sola molécula. A partir de las huellas como éstas se puede obtener la eficiencia de FRET que informa sobre la instantánea donante-aceptor de separación, que a su vez se utiliza para explorar la estructura y dinámica de las moléculas de interés biológico. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: células de microfluidos con cuatro canales, cada uno con entrada / salida de los capilares. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Cell montado en el microscopio listo para las mediciones. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: Configuración de los SM-FRET mediciones. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /> Las figuras 4 y 5: canal rojo y el verde de una exploración de superficie de inmovilizado FRET moléculas excitadas con láser verde. Por favor, haga clic para ver una versión ampliada de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">la figura 4</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">la figura 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figura 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figura 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figura 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figura 9" border="0" /> Figuras 6, 7, 8 y 9: Intensidad de las trayectorias de los donantes (verde) y aceptor (rojo) fluoróforos etiqueta a una molécula de ADN 8, 10, 16 y 18 pares de bases de distancia. Por favor, haga clic para ver una versión ampliada de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">la figura 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figura 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figura 8</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">la figura 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Aunque el protocolo anterior ha sido optimizado para el sistema en particular y para una elección específica de los tintes (TMR y ATTO647N), que no es el único método probado. Recientemente, un sistema de oxígeno alternativos de barrido que consiste en ácido protocatéquico (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxigenasa (PCD) ha demostrado aumentar la fotoestabilidad de determinados colorantes 4. Del mismo modo, otro estado triplete, como apagar la β-mercaptoetanol (BME) se puede utilizar en lugar de Trolox, aunque no podría suprimir de larga duración intermitente de algunos colorantes, en particular, Cy5 5. A pesar de la inmovilización a través de biotina-estreptavidina-biotina albúmina de suero bovino (BSA) es la opción preferida para los estudios de los ácidos nucleicos, un polietilenglicol (PEG)-superficie cubierta es más adecuado para los estudios de las proteínas, ya que evita adhesión no específica 1. Además, la difracción de sub-limitada-vesículas de tamaño se puede utilizar para encapsular las biomoléculas de interés en los casos en que puede verse afectada por las interacciones de superficie 6. En este artículo hemos utilizado una configuración confocal equipado con silicona fotodiodos de avalancha para adquirir las huellas intensidad de la fluorescencia. Este protocolo funciona igual de bien con el total de los microscopios de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) equipados con cámaras CCD. Independientemente de la microscopía de utilizar, sm-FRET puede informar sobre la resolución espacial se acerca el angstrom cuando el donante y el receptor de la señal están debidamente corregido el 7.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) microscopía se ha utilizado ampliamente para estudiar la estructura y dinámica de las moléculas de interés biológico, tales como los ácidos nucleicos y proteínas. Sola molécula FRET (sm-FRET) mediciones en las moléculas inmovilizadas permitir observaciones de largo del sistema de forma efectiva hasta que ambos colorantes photobleach-que resulta en el tiempo las huellas que el informe sobre la dinámica de biomoléculas con una amplia gama de escalas de tiempo de milisegundos a minutos. Para facilitar la adquisición de gran número de huellas para el análisis estadístico, el proceso debe ser automatizado y el medio ambiente de la muestra debe ser estrechamente controlada por el tiempo de medición completa (~ 12 horas). Esto se logra utilizando un microscopio confocal de barrido automático que permite el interrogatorio de miles de moléculas individuales durante la noche, y una célula de microfluidos que permite el intercambio controlado de tampón, con el contenido de oxígeno restringido y mantiene una temperatura constante durante todo el período de medición. Aquí se muestra cómo montar el dispositivo de microfluidos y de cómo activar su superficie para la inmovilización de ADN. A continuación se explica cómo preparar un amortiguador para maximizar la fotoestabilidad y la duración de los fluoróforos. Finalmente, se muestran los pasos a seguir en la preparación de la instalación para la adquisición automática de la resolución temporal sola molécula FRET trazas de moléculas de ADN.

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Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vistas.  Boston University. En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Video: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Investigación

Biología

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de Chlamydomonas centriolos

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

Reconstrucción de firmas de fluorescencia innata unicelular mediante microscopía confocal

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...