والكتاب أود أن أشكر نانسي داونر وجميع أعضاء من مختبر الكيمياء التحليلية من جامعة روما &quot;تور فيرغاتا&quot; للتعاون والدعم اللوجستي. وأيد هذا العمل من قبل &quot;BioCop&quot; مشروع الاتحاد الأوروبي.

1) حظر الخرز المغناطيسي المغلفة : المضي قدما على النحو التالي لعرقلة الخرز المغناطيسي المغلفة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة من أنابيب إيبندورف 2 مل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس (الهز ولكن ليس vortexing) حبات مغلفة المغناطيسي (انظر الملحق لإعداد حبات المغناطيسي مغلفة) باستخدام عينة الدورية خلاط ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التجانس ، ماصة 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي في كل الأنابيب المغلفة إيبندورف منفصلة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1ml من الحليب منزوع الدسم عرقلة الحل في كل أنبوب إيبندورف من المجموعة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الخرز المغناطيسي احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على خلاط نموذج الدورية ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحجب الحل : أن تفعل ذلك في مكان الأنبوب المكثف الجسيمات المغناطيسية مع الجزء المغناطيسي وضعت على لمدة 2 دقيقة (انظر الخرز المغناطيسي شائكة على الجدار الجانبي للأنبوب) ؛ ماصة بعناية قبالة طاف ، تاركا حبات دون عائق ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من نان PBS عازلة + 3 + جيش صرب البوسنة باعتبارها حلا لتخزين كل أنبوب ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين حبات المغناطيسي المغلفة وسدت في 4 درجات مئوية (يرجى ملاحظة أن حبات المغناطيسي المغلفة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أشهر على 4 درجات مئوية) ؛ </li></ol> 2) سلسلة مناعية على حبات المغناطيسي لبناء منحنى المعايرة وتحليل العينات المضي قدما على النحو التالي أن يكون جاهزا الخرز المغناطيسي لقياس : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ واحدة إيبندورف أنبوب (2 مل) من حل المغلفة وسدت لكل استخراج عينة أنت ذاهب لتحليل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ أنبوب إيبندورف إضافية لكل حل calibrant العمل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الخرز المغناطيسي لمدة 2 دقيقة على خلاط نموذج الدورية قبل الاستعمال ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السائل التخزين باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات المغناطيسي ثلاث مرات بمحلول الغسيل PBS / جيش صرب البوسنة. إزالة غسل السائل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة المنافسة : أضف لكل أنبوب يحتوي على حبات غسلها المغناطيسي ، واستخراج عينة من 200μl أعدت ، واستخدام أنبوب واحد لكل حبة المغناطيسي العينة. كرر نفس الإجراء لكل حل القياسية. إضافة 200 ميكرولتر من محلول ريتوكسيماب إلى أنبوب كل حبة المغناطيسي. اسمحوا الخرز المغناطيسي احتضان لمدة نصف ساعة على خلاط نموذج الدورية في درجة حرارة الغرفة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنابيب من إيبندورف الحل المستخدمة في خطوة المنافسة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسم الخطوة : أضف 400μl من الأجسام المضادة الثانوية المسمى لكل أنبوب المغناطيسي إيبندورف حبة. اسمحوا الخرز المغناطيسي احتضان لمدة نصف ساعة على خلاط نموذج الدورية في درجة حرارة الغرفة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العلامات من حل أنابيب إيبندورف ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات المغناطيسي ثلاث مرات مع PBS / توين ® 20 حل الغسيل. إزالة السائل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 100μl مع كل من إدارة مكافحة المخدرات العازلة قسامة من الخرز المغناطيسي. الآن الخرز المغناطيسي مستعدون للخطوة القياس الكهروكيميائية ؛ </li></ol> 3) جمعية PalmSens مع الخيارات (مسك الغزال) المضاعف يرجى ملاحظة : المنتج من التحلل الأنزيمي الركيزة الأخطاء سطح القطب ، ولهذا السبب هناك حاجة إلى القطب جديد لكل قياس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل جهاز الكمبيوتر المحمول إلى الكمبيوتر عن طريق كابل PalmSens المسلسل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل القابس من 9 - DIN مع PalmSens CH8 المضاعف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتصال كبل تسلسلي الثمانية قناة اتصال مع مسك الغزال الكهربائية CH8 المضاعف ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريط الكهربائي على كتلة المغناطيس ثمانية. الالتفات الى كل مكان تحت كل أقطاب المغناطيس العمل (لاحظ ، على ضرورة وجود مغناطيس كهربائي واحد لكل أمر حتمي وإلا سوف لا الجسيمات المغناطيسية أن يتركز على منطقة القطب العمل) ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سد العجز في قطاع غزة إلى ثمانية أقطاب كهربائية قناة اتصال مسك الغزال ؛ </li></ol> لقياس DPV استخدام المعلمات التالية في المربعات المناسبة : E تبدأ : 0 (V) ؛ نهاية E : 0.6 (V) ؛ الخطوة الخامسة : 0.016 (V) ؛ E نبض : 0.0339 (V) ؛ E تكييف : معدل المسح الضوئي ؛ : ؛ 0 (V) 0 (V) ترسب E : 0.1 (V / ث) ؛ T نبض : 0.06 (ق) ؛ T تكييف : 0 (ق) ؛ T ترسب : 0 (ق) ؛ T موازنة : 8 (ق). 4) رد الفعل الأنزيمية والقياس الكهروكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس التي تهز برفق كل أنبوب إيبندورف تحتوي حبات المغناطيسي على استعداد للخطوة القياس الكهروكيميائية من أجل الحصول على تعليق من الخرز كذلك فرقت المغناطيسي ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة من كل إيبندورف ، مباشرة بعد التجانس ، وقسامة من 20 ميكرولتر من التشتت حبة المغناطيسي على سطح القطب المقابل العمل. لكل قطب من استخدام شريط واحد 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المأخوذة من أنابيب إيبندورف مختلفة (على سبيل المثال لاستخدام القطب eight eight إيبندورف مختلفة) ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر حل الركيزة الأنزيمية على القطب الأول. بدء العد التنازلي 2 دقيقة. بعد 14 ثانية ، إضافة 80 ميكرولتر من محلول الركيزة الأنزيمية على القطب الثاني. بعد 14 ثانية أخرى ، إضافة 80 ميكرولتر من محلول الركيزة الأنزيمية في القطب الثالث. المضي قدما في الوقت نفسه مادباerval (14 ثانية) حتى القطب الماضي (وهذا يعني : كل قطرة من قسامة الركيزة مع فترات من 14 ثانية). ويتم احتساب الوقت الفاصل الزمني من 14 ثانية والوقت اللازم من قبل potentiostat لأداء القياس ؛ من المذكرة ، فإن الحل 80 ميكرولتر على كل أجهزة الاستشعار ينبغي أن تغطي القطب العمل ، ومرجعية وصفة طبية. وعلاوة على ذلك ، ينبغي للحلول لكل مجس لا تتلامس مع حلول من الأقطاب الكهربائية المجاورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 دقيقة العد التنازلي من اضافة اولى حل الركيزة الأنزيمية ، بدء القياس الكهروكيميائية ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برامج لايت PalmSens للحصول على قمم الحالية (أمبير) لكل حل. </li></ol> 5) حساب إنشاء منحنى المعايرة باستخدام معادلة لوجستية 4 معلمات وحساب المبلغ الإجمالي تركيز السم في HT-2/T-2 نانوجرام لكل ملليلتر لكل عينة تحتوي على أنبوب إيبندورف مجهولة. البيانات التجريبية ، وارتفاع الذروة (أمبير) مقابل تركيز calibrants (نانوغرام / مل) ، يجب أن تكون مجهزة لاستعمال غير الخطية أربعة المعلمة لوجستية (4 - PL) مؤامرة المعادلة (1) (سيغما باستخدام قطعة أو 8.0 Kaleidagraph). يعتمد عادة غير الخطية 4 - PL نموذج لوصف المقايسات ملزم يجند (LBAs) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> (1) أ ، ب ، X0 ، y0 معلمات اللوجستي والتي قدمها البرنامج مؤامرة سيغما تناسب المنحنى. استخدام صيغة لحساب يفسر من محتوى HT-2/T-2 السم المبلغ الإجمالي في حل استخراج عينة المخففة <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> (2) x هو تركيز كتلة من المبلغ الإجمالي للHT-2/T-2 السموم في حل استخراج المخفف ، وتحسب من المعادلة 4 معلمات لوجستية في نانوغرام لكل milliltre (نانوغرام / مل) y هو القيمة الحالية في أمبير الحصول على عينة غير معروفة ملحق 6) المغناطيسي الخرز المغلفه المضي قدما على النحو التالي أن يكون مطلي الخرز المغناطيسي : الغسيل الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس Dynabeads tosylactivated ® M - 280 (2 × الأسهم حل حبات 109 / مل) من الهز وvortexing (سرعة قصوى) لمدة 1 دقيقة (تجنب الرغوة) (يرجى ملاحظة تركيز حبات المغناطيسي يجب أن يكون دائما هو نفسه لضمان تكرارية في قياس) ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة فورا 1 مل من الخرز والمتجانس أعلاه في أنبوب 2 مل إيبندورف ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب في الجسيمات المغناطيسية المكثف مع الجزء المغناطيسي وضعت على لمدة 2 دقيقة (انظر الخرز المغناطيسي شائكة على الجدار الجانبي للأنبوب) ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بعناية قبالة طاف ، تاركا حبات دون عائق ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب إيبندورف المكثف من الجسيمات المغناطيسية وresuspend حبات في 1 مل من 0.1 درجة الحموضة عازلة M بورات 9.5. المزيج برفق لمدة 2 دقيقة في الخلاط عينة بالتناوب لمدة 2 دقيقة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة قبالة طاف ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 مل من محلول بورات عازلة داخل الأنبوب إيبندورف. الخرز المغناطيسي على استعداد الآن للخطوة الطلاء ؛ </li></ol> طلاء الداخلي <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 مل من HT - 2 مترافق مع الحل KLH الأسهم (الخادم Keyhole هيموسيانين بطلينوس) إلى 1 مل من الخرز المغناطيسي) (نهائي HT - 2 - KLH تركيز 375 ملغ / مل) ؛ الخرز المغناطيسي احتضان والحل HT - 2 - لKLH 20h عند 37 درجة مئوية * مع دوران بطيء على الميل الدورية خلاط نموذج ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مكان الحضانة الأنبوب المكثف في الجسيمات المغناطيسية وماصة قبالة طاف ؛ تغسل حبات مغلفة مرتين مع 1 مل من محلول العازلة PBS / جيش صرب البوسنة. بين كل غسيل إزالة PBS / BSA الحل. أجريت كل خطوة الغسيل وضع الخرز المغناطيسي وPBS / جيش صرب البوسنة على خلاط الدورية لمدة 5 دقائق ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات المغناطيسي به مرة واحدة 1 مل من محلول العازلة TRIS / جيش صرب البوسنة. إزالة TRIS / حل جيش صرب البوسنة. القيام بهذه الخطوة عن طريق وضع الخرز المغناطيسي والعازلة TRIS / جيش صرب البوسنة على الدورية خلاط لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية * ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات المغناطيسي مرة واحدة باستخدام 1ml من منتعشة (يحتفظ بها في الثلاجة على 4 درجات مئوية) PBS / BSA حل العازلة. إزالة PBS / BSA الحل. تنفيذ هذه الخطوة وضع الخرز المغناطيسي والعازلة PBS / جيش صرب البوسنة على الدورية للخلاط 5min في درجة حرارة الغرفة ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل السائل الخطوة إزالة كافة الغسيل وإضافة 1 مل PBS العازلة نان + 3 + جيش صرب البوسنة وتخزين السائل ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين حبات المغناطيسي المغلفة في 4 درجات مئوية (يرجى ملاحظة أن حبات المغناطيسي المغلفة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أشهر على 4 درجات مئوية) ؛ </li></ol> * ولهذا الغرض يوضع في الفرن خلاطة مجهزة حفرة الذي يسمح للالإدراج من كابل لامدادات الطاقة. بدلا من ذلك يمكن أن يوضع في الخلاط في غرفة thermostated عند 37 درجة مئوية. 7) إعداد واستخراج عينة 25 غ من العينة المطحون ناعما (أغذية الأطفال أو الفطور الحبوب) نحنighed في وعاء الخلاط وانتزعت مع 100 مل من أسيتونتريل / المحلول المائي (86/14) لمدة 3 دقائق في خلاط عالية السرعة. بعد الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة (3000 ز) لمدة 5 دقائق ، اتخذت 8 مل من طاف وتنقيته مع العمود Mycosep ، والمجففة 4 مل من مستخلص تنظيفها تحت تدفق النيتروجين. ويمكن تخزين العينات المجففة في -30 درجة مئوية تصل إلى عدة أشهر. 8) إعادة تشكيل نموذج إفطار الحبوب إعادة تشكيل حبوب الافطار المجففة استخراج (الغذائية من الحبوب المخصصة للاستهلاك تستند الكبار) مع 40 مل من الحموضة PBS 7.4. بهذه الطريقة سوف عينة مع تركيز السم المساواة القانونية للحد من المفترض (200 نغ / غ) في خطوة تعطي قياس إشارة سقوطه في منتصف نطاق العمل. طعام للأطفال إعادة تشكيل أغذية الأطفال المجففة استخراج (الغذائية من الحبوب المخصصة للاستهلاك تستند الرضع) مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. بهذه الطريقة سوف عينة مع التركيز على قدم المساواة من السموم للحد من المفترض القانونية (20-25 نانوغرام / غرام) في خطوة تعطي إشارة القياس التي سقطت في منتصف نطاق العمل.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

وقد شهد استخدام الأجسام المضادة وتحقيق الاعتراف الجزيئية البيولوجية استخدام تقنيات الاستشعار عن بعد على نطاق واسع ل؛ منهجيات الكشف immunochemical ، مثل ELISAs وMEIAs ، هي ، في الوقت الحاضر ، من بين المنصات المستخدمة وتطبيقها في العديد من المختبرات 7. <p class="jove_content" style=";text-...

الكواشف <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> كلوريد البوتاسيوم </td><td> سيغما </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروجين فوسفات البوتاسيوم </td><td> سيغما </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات ثنائي الصوديوم الهيدروجينية </td><td> سيغما </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> 2 MgCl اللامائية </td><td> سيغما </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99.5 ٪) </td><td> سيغما </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك 37 ٪ </td><td> سيغما </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> سيغما </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> تريس [hydroxymethyl] - aminomethane </td><td> سيغما </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (ألبومين المصل البقري) </td><td> سيغما </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> توين 20 </td><td> سيغما </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> نان 3 </td><td> الدريتش </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - النفثول الفوسفات ثنائي الصوديوم الملح </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> منزوع الدسم الحليب عرقلة الحل -- غير دهن الحليب الجاف </td><td> الحيوي راد </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2 مترافق مع KLH (الخادم Keyhole هيموسيانين البطلينوس) ، حل سهم (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) : </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> تم الحصول على المتقارن HT - 2 - KLH - CDI حسب الطريقة التي تم تنشيط الحرة OH - مجموعات على موقف 3 و 4 في السم HT - 2 بواسطة N ، N&#39; - carbonyldiimidazole (CDI) وتنشيط HT - 2 توكسين كان السماح للتفاعل مع aminogroups من البروتين (KLH) لإنشاء الربط carbammate مستقرة. </td></tr><tr><td> الثانوية الضد المسمى : مكافحة الماوس مفتش (H + L) من الخيل ، مترافق مع الفوسفاتيز القلوية ، وتركيز 1 ملغ / مل. </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> AP - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2 توكسين </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الخرز المغناطيسي : Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M - 280 Tosylactivated </td><td> تركيز 2 × 10 9 حبات / مل. </td></tr></table> الحلول <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> إعداد </td><td> تعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> حل 0،20 غرام من كلوريد البوتاسيوم ، 0.20 غرام من فوسفات هيدروجين البوتاسيوم ، 1،16 غرام من فوسفات الصوديوم والهيدروجين 8.00 جرام من كلوريد الصوديوم في 900 مل من الماء </td><td></td></tr><tr><td> الديثانولامين العازلة ، DEA ، 0.97 M + 1 ملم MgCl 2 + 0.15 م بوكل ، ودرجة الحموضة 9.8 </td><td> حل 0.0476g من 2 MgCl اللامائية و7.3.59 غرام من بوكل في 300 ~ مل من الماء. بعد انحلال إضافة 51 مل من إدارة مكافحة المخدرات (99.5 ٪). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.8 مع حمض الهيدروكلوريك (6 م). مخفف الى 500 مل من الماء. </td><td></td></tr><tr><td> بورات العازلة ، 0.1 م ، ودرجة الحموضة 9.5 </td><td> حل 3،09 غرام من H 3 BO 3 في 300 ~ مل من الماء المقطر ، ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.5 و / أو حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم (6 م أو أقل تركيزات). مخفف الى 500 مل من الماء المقطر. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS العازلة ، 0.2 م ، ودرجة الحموضة 8.5 </td><td> حل 3،85 غرام من تريس [hydroxymethyl] - aminomethane في 100 مليلتر من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 8.5 و / أو حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم (6 م أو أقل تركيزات). مخفف الى 200 مل من الماء. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS عازلة + حل جيش صرب البوسنة (0.1 ٪) ، ودرجة الحموضة 8.4 </td><td> حل 0.050 غرام من جيش صرب البوسنة في 50 مل من الحموضة عازلة TRIS 8.4. </td><td> يجب أن يكون هذا الحل الطازجة في اليوم للاستخدام. </td></tr><tr><td> PBS عازلة + توين ® 0.05 ٪ </td><td> حل 0.250 غرام من توين 20 في 500 مل من المخزن برنامج تلفزيوني أعد سابقا ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS العازلة حل جيش صرب البوسنة + 0.1 ٪ </td><td> حل 0.050 غرام من جيش صرب البوسنة في 50 مل من المخزن برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.3. </td><td> يجب أن يكون هذا الحل الطازجة في اليوم للاستخدام. </td></tr><tr><td> PBS عازلة + 0.1 ٪ + جيش صرب البوسنة نان 3 0.02 ٪ </td><td> حل 0.050 غرام من جيش صرب البوسنة و0،010 نان من 3 في 50 مل من المخزن برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.3. </td><td> تخزين سولution </td></tr><tr><td> الركيزة الأنزيمية </td><td> حل 0.010 غرام من 1 النفثول فوسفات الصوديوم في 100 مل من الحموضة عازلة DEA 9.8. التفاف القارورة بإحكام بورق الألمنيوم. </td><td> يجب أن يكون هذا الحل الطازجة في اليوم للاستخدام. </td></tr><tr><td> منزوع الدسم الحليب عرقلة الحل </td><td> إضافة 0،20 غرام من التنشيف الصف حظر غير دهن الحليب الجاف (بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى 200 مل من برنامج تلفزيوني العازلة الحموضة 7.3. </td><td> يجب أن يكون هذا الحل الطازجة في اليوم للاستخدام. </td></tr><tr><td> HT - 2 الاسهم الحل </td><td> حل 10 ملغ من HT - 2 trichothecene قارورة السم ، في 10 مل من أسيتونتريل لإعطاء الحل مع تركيز 1 ملغ / مل. </td><td> تقسيم هذا الحل في استخدام المفرد aliquots من 30 مل وتخزينها في أقل من -30 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> HT - 2 العامل حل القياسية </td><td> ماصة 20 مل من HT - 2 توكسين حل البورصة إلى 2 مل معايرة الدورق الحجمي وتمييع مع أسيتونتريل للحصول على حل HT - 2 العمل تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من السم trichothecene. </td><td> وينبغي أن يكون هذا الحل الطازجة في اليوم للاستخدام. </td></tr><tr><td> HT - 2 حلول calibrant العامل </td><td> تمييع HT - 2 الحل معيار العمل (10 ميكروغرام / مل) لإعداد حل calibrant العمل 100 نانوغرام / مل. تمييع HT - 2 العاملة حل calibrant 100 نانوغرام / مل لإعداد العاملين حلول calibrant لتركيزات التالية 0 (فارغة) ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 ، 10 نانوغرام / مل. </td><td> يجب أن يكون مستعدا هذه الحلول الطازجة في اليوم للاستخدام. </td></tr><tr><td> HT - 2 مترافق مع KLH </td><td> تقسيم HT - 2 مترافق مع الحل KLH الأسهم (الخادم Keyhole هيموسيانين البطلينوس) (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) في واحد استخدام aliquots من 350 ميكرولتر. </td><td> aliquots المحل في -30 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> ضد وحيد النسيلة محددة </td><td> تمييع 1:350 (ت : ت) تركيز المخزون (1،383 ملغ / مل) من ريتوكسيماب في برنامج تلفزيوني ، لاستخدامها في خطوة المنافسة </td><td> يجب أن يكون مستعدا هذا الحل الجديد في لحظة استخدامها. 10 مل الأسهم الضد الحل في برنامج تلفزيوني عن الحجم النهائي من 3.5 لتر ، ما يكفي لتحليل المعايير 17 و / أو عينات. </td></tr><tr><td> إعتبر جسم الثانوية </td><td> غير المخفف المضادة للمفتش الماوس (H + L) مترافق مع الفوسفاتيز القلوية 1:100 (ت : v) في برنامج تلفزيوني ، لاستخدامها في خطوة المنافسة. </td><td> 100 سهم الضد ميكرولتر الحل في برنامج تلفزيوني عن الحجم النهائي من 10 مل تكفي لتحليل المعايير 25 و / أو عينات. يجب أن يكون مستعدا هذا الحل الجديد في لحظة استخدامها. </td></tr></table> جهاز <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> تعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> الجسيمات المغناطيسية المكثف : MPC ® - S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens الصك </td><td> PalmSens </td><td> قدمت مع لايت PalmSens ، المسلسل المحمول كابل ربط الكمبيوتر والبرمجيات خيارات مسك الغزال </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens المضاعف </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> ثمانية قناة اتصال الكهربائية مسك الغزال </td><td> اليد التي قدمت </td><td></td></tr><tr><td> مع أقطاب قطاع الشاشة eight المطبوعة (الكيانات الخاصة الغرض) </td><td> اليد التي قدمت </td><td></td></tr><tr><td> المصممة خصيصا لدعم قطاع الأقطاب </td><td> اليد التي قدمت </td><td> يتضمن المغناطيس النيوديميوم 8 كل واحدة منها وضعت تحت سطح القطب كل عمل SPE </td></tr><tr><td> ماصات معايرة ميكروليتر </td><td> جيلسون </td><td></td></tr><tr><td> النمام المغناطيسي وقضبان ضجة. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الأكواب الزجاجية (100 ، 50 ، 20 مل). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الحجمي القوارير (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 و 2ml أنابيب إيبندورف. </td><td> إيبندورف </td><td></td></tr><tr><td> الصقر ™ من أنابيب و5ml 15ml. </td><td> صقر </td><td></td></tr><tr><td> مختبر دوامة خلاط </td><td></td><td> لا تستخدم لدوامة خلاط resuspend الخرز المغناطيسي المغلفة مع HT2 - KLH أو مرتبطة مع سلسلة المناعية لتفادي تغيير طبيعة قطع بروتيني </td></tr><tr><td> فرن مختبر أو غرفة thermostated </td><td></td><td> اختيار الفرن قادرة على الحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية ± 3 </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

المناعية هي بديل صالح للاستهلاك كمية HPLC أكثر كلفة والوقت أو GC 1 ، 2 طرق للكشف فحص السموم الفطرية الخطرة في السلع الغذائية. في هذا البروتوكول نظهر كيفية تلفيق واستجواب انزيم الكهروكيميائية تنافسية مقايسة immunomagnetic مرتبط على أساس استخدام الخرز المغناطيسي ودعما قويا لسلسلة immunochemical 3 و أقطاب الشاشة المطبوعة والاستشعار عن منصة. لدينا وسيلة تهدف إلى تحديد المبلغ الإجمالي للHT - 2 و T - 2 السموم ، والسموم الفطرية تعود لعائلة trichothecenes وقلق كبير على صحة الإنسان 4. استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ عبر التفاعل مع 100 ٪ من نحو 2 و HT - 2 - T يسمح للكشف عن السموم في وقت واحد على حد سواء مع حساسية مماثلة 5. الخطوة الأولى للمقايسة لدينا هي الخطوة طلاء أين نحن شل HT2 - KLH السم المتقارن على السطح من الخرز المغناطيسي. بعد خطوة الحجب ، من الضروري تجنب الجواذب غير محددة ، وإضافة ريتوكسيماب يسمح المنافسة بين يجمد HT - 2 و HT - 2 مجانا أو T - 2 موجودة في العينة أو الذائب في محلول قياسي. في نهاية هذه الخطوة من حيث المنافسة ، وكمية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ترتبط يجمد HT - 2 سوف تكون متناسبة عكسيا مع كمية من السم في حل العينة. وتستخدم الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) للكشف عن الربط بين الأجسام المضادة المحددة ويجمد HT - 2. يتم تنفيذ الخطوة النهائية قياس ألقت عليه قسامة التعليق حبة المغناطيسي ، والمقابلة لحل محدد / نموذج قياسي ، على سطح القطب الشاشة المطبوعة في العمل ، ويتم يجمد الخرز المغناطيسي ومركزة عن طريق المغناطيس وضعت على وجه التحديد في إطار الشاشة المطبوعة الكهربائي. بعد دقيقتين من الحضانة بين حبات المغناطيسي وركيزة لأب ، يتم الكشف عن المنتج الأنزيمية التي Voltammetry نبض التفاضلية (DPV) باستخدام أداة محمولة (PalmSens) قادرة أيضا على بدء تلقائيا eight قياسات ضمن فاصل زمني من بضع ثوان.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

ويتجلى بروتوكول للكشف عن trichothecenes (السموم الفطرية للقلق على الصحة البشرية) باستخدام أسلوب الفحص وضعت حديثا على أساس أسلوب immunochemical تنافسية وكشف الكهروكيميائية النهائي.

ELIME (انزيم مرتبط المناعي المغناطيسي الكهروكيميائية) طرق الكشف عن السموم الفطرية

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K Views.  University of Rome, Tor Vergata. ويتجلى بروتوكول للكشف عن trichothecenes (السموم الفطرية للقلق على الصحة البشرية) باستخدام أسلوب الفحص وضعت حديثا على أساس أسلوب immunochemical تنافسية وكشف الكهروكيميائية النهائي.

Video: ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

عزل النوى عن الأنسجة الكاملة باستخدام المنظفات وطريقة خالية من الانزيم

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.