המחברים מבקשים להודות ננסי דאונר וכל חברי מהמעבדה של כימיה אנליטית, אוניברסיטת רומא &quot;טור Vergata&quot; על שיתוף הפעולה שלהם ותמיכה לוגיסטית. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי את הפרויקט &quot;BioCop&quot;.

1) חסימה חרוזים מגנטיים מצופה: המשך כמו בצע לחסום חרוזים מגנטי מצופה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מערכת של 2 צינורות מ&quot;ל Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize (רועד אך לא vortexing) חרוזים מגנטיים מצופה (ראה נספח להכנת חרוזים מגנטיים מצופה) באמצעות מדגם מסתובבת מערבל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר homogenization, פיפטה 10 μl של חרוזים מגנטיים מצופה לתוך כל צינורות נפרדים Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של חלב דל שומן חוסם פתרון לתוך הצינור כל Eppendorf של קבוצת; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו חרוזים מגנטיים דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מיקסר מדגם מסתובב; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת חסימה הפתרון: לעשות זאת במקום הצינורית concentrator החלקיקים המגנטיים עם החלק המגנטי לשים על 2 דקות (ראה חרוזים מגנטיים דבק על הקיר לרוחב של הצינור); בזהירות פיפטה את supernatant, עוזב חרוזים באין מפריע; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של PBS חיץ NaN + 3 + BSA כפתרון אחסון עבור כל צינור; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חרוזים מגנטיים מצופה חסום ב 4 ° C (שים לב חרוזים מגנטיים מצופה יציבים לפחות 2 חודשים 4 ° C); </li></ol> 2) שרשרת החיסוני על חרוזים מגנטיים לבנייה של עקומת הכיול וניתוח מדגם המשך כמו בצע יש חרוזים מגנטיים מוכן למדידה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח אחד Eppendorf צינור (2 מ&quot;ל) של פתרון מצופה חסומים לחלץ כל דגימה שאתה הולך לנתח; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו צינור נוסף Eppendorf לפתרון כל calibrant עבודה; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize חרוזים מגנטיים עבור 2 דקות על מיקסר מדגם מסתובב לפני השימוש; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת נוזל אחסון באמצעות concentrator החלקיקים המגנטיים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם פתרון PBS / BSA כביסה. הסר כביסה נוזלי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב התחרות: הוסף עבור כל שפופרת המכילה חרוזים שטף מגנטי, 200μl מדגם מוכן לחלץ; להשתמש באחד צינור חרוז מגנטי עבור כל דגימה. חזור על אותו תהליך עבור כל פתרון סטנדרטי. הוסף 200 μl של פתרון נוגדן חד שבטי כדי צינור כל חרוז מגנטי. תנו חרוזים מגנטיים דגירה במשך חצי שעה על מיקסר מדגם מסתובב בטמפרטורת החדר; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות Eppendorf הפתרון משמש שלב התחרות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג צעד: הוסף 400μl של נוגדנים משני שכותרתו כל צינור מגנטי Eppendorf חרוז. תנו חרוזים מגנטיים דגירה במשך חצי שעה על מיקסר מדגם מסתובב בטמפרטורת החדר; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תיוג פתרון משפופרות Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם PBS / tween ® 20 הפתרון כביסה. הסר את נוזלי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עם 100μl של ה-DEA חיץ כל aliquot חרוזים מגנטיים. עכשיו חרוזים מגנטיים מוכנים לשלב מדידה אלקטרו; </li></ol> 3) האסיפה של PalmSens עם מרבב (MUX) אפשרויות שימו לב: מוצר הידרוליזה אנזימטית של המצע עבירות על פני האלקטרודה, ומסיבה זו אלקטרודה חדשה נדרשת לכל מדידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור המחשב הנייד כדי PalmSens דרך כבל סדרתי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את תקע 9-DIN של מרבב CH8 עם PalmSens. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור כבל טורי של קשר שמונה ערוץ Mux חשמלי עם מרבב CH8; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה מקום רצועה ברחוב מגנט שמונה. שימו לב בכל מקום מגנט תחת כל אלקטרודות עבודה (לשים לב, את הצורך של מגנט יחיד עבור כל אלקטרודה הכרחי אחרת החלקיקים המגנטיים לא יהיה מרוכז באזור האלקטרודה עובד); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את רצועת אלקטרודות במגע eight ערוץ Mux חשמלי; </li></ol> עבור המדידה DPV להשתמש בפרמטרים הבאים בתיבות המתאימות: E להתחיל: 0 (V); בסוף E: 0.6 (V); צעד E: 0.016 (V); E הדופק: 0.0339 (V); E מיזוג: 0 (V); בתצהיר E: 0 (V); קצב סריקה : 0.1 (V / s); T הדופק: 0.06 (ים); מיזוג T: 0 (s); בתצהיר T: 0 (s); איזון T: 8 (ים). 4) התגובה האנזימטית אלקטרוכימי מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ידי בעדינות רועד כל צינור Eppendorf המכילה חרוזים מגנטיים מוכן לשלב מדידה אלקטרו מנת לקבל השעיה מפוזר היטב של חרוזים מגנטיים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מכל Eppendorf, מיד לאחר homogenization, aliquot של 20 μl של פיזור חרוז מגנטי על משטח אלקטרודה המקביל העבודה. עבור כל אלקטרודה של להשתמש באחד רצועה 20 μl של חרוזים מגנטיים שנלקחו שונים צינורות Eppendorf (למשל לשימוש eight eight אלקטרודה Eppendorf שונים); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה הראשונה. התחל 2 דקות לספור למטה. לאחר 14 שניות, להוסיף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה השנייה. אחרי עוד 14 שניות, להוסיף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה השלישית. המשך ב int באותו זמןerval (14 שניות) עד אלקטרודה האחרון (כלומר: כל טיפה aliquot המצע במרווחים של 14 שניות). השעה מרווח של 14 שניות מחושב הזמן הנדרש על ידי potentiostat לבצע את המדידה, של לב, הפתרון 80 μl על חיישן זה אמור לכסות את האלקטרודה, עובד התייחסות נגדית. יתר על כן, פתרונות חיישן אחד לא צריך לבוא במגע עם פתרונות של אלקטרודות השכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 דקות לספור למטה בנוסף הראשון של פתרון המצע האנזימטית, להתחיל את המדידה אלקטרוכימי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Lite PalmSens תוכנה כדי להשיג פסגות הנוכחי (μA) עבור כל פתרון. </li></ol> 5) חישוב הקמת עקומת כיול באמצעות משוואה לוגיסטית 4 פרמטרים ולחשב את ריכוז כמות HT-2/T-2 סך הרעלן ננוגרם למיליליטר עבור כל שפופרת המכילה Eppendorf מדגם לא ידוע. נתוני הניסוי, גובה השיא (μA) נגד ריכוז calibrants (ng / ml), צריך להיות מצויד שימוש שאינו ליניארי ארבע פרמטר לוגיסטי (4-PL) העלילה המשוואה (1) (באמצעות מגרש סיגמא 8.0 או Kaleidagraph). המודל קוי 4-PL מאומץ בדרך כלל כדי לתאר את מבחני מחייב ליגנד (LBAs) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> (1) a, b, x0, Y0 פרמטרים לוגיסטיים כמו שניתן על ידי תוכנית עקומת Sigma מגרש מתאים. השתמש בנוסחה כדי לחשב ולהסביר את התוכן של הסכום הכולל HT-2/T-2 הרעלן הפתרון מדגם בדילול לחלץ <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> (2) x הוא ריכוז מסה של הסכום הכולל של HT-2/T-2 רעלים פתרון תמצית מדוללת, מחושב מן המשוואה 4 פרמטרים לוגיסטי Nanogram לכל milliltre (ng / ml) y הוא הערך הנוכחי μA שהתקבלו במדגם לא ידוע נספח 6) חרוזים מגנטיים מצופה המשך כמו בצע יש חרוזים מגנטי מצופה: כביסה נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize Dynabeads tosylactivated ® M-280 (פתרון המניה 2 x 109 חרוזים / ml) על ידי רועדת vortexing (מהירות מרבית) דקות 1 (למנוע הקצפה) (נא לציין את הריכוז של חרוזים מגנטיים צריך להיות תמיד זהה, כדי להבטיח שחזור ב המדידה); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד פיפטה 1 מ&quot;ל של חרוזים הומוגני לעיל לתוך צינור 2 Eppendorf מ&quot;ל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית concentrator החלקיקים המגנטיים עם החלק המגנטי לשים על 2 דקות (ראה חרוזים מגנטיים דבק על הקיר לרוחב של הצינור); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה את supernatant, עוזב חרוזים באין מפריע; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך Eppendorf concentrator החלקיק המגנטי resuspend את החרוזים מ&quot;ל 1 של ה-pH 0.1 borate חיץ M 9.5. מערבבים בעדינות במשך 2 דקות במיקסר המדגם סיבוב 2 דקות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של תמיסת חיץ borate לתוך הצינור Eppendorf. חרוזים מגנטיים נמצאים כעת מוכן לשלב ציפוי; </li></ol> ציפוי נוהל <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 600 מ&quot;ל של HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH כדי מ&quot;ל 1 של חרוזים מגנטיים) (סופי HT-2-KLH ריכוז של 375 מ&quot;ג / מ&quot;ל); חרוזים מגנטיים לדגור HT-2-KLH פתרון 20h ב 37 ° C * עם סיבוב איטי על הטיה וסיבוב מיקסר מדגם; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי מקום דגירה את הצינורית concentrator החלקיקים פיפטה מגנטי את supernatant; לשטוף חרוזים מצופים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של תמיסת PBS / BSA חיץ. בין כביסה להסיר כל PBS / BSA פתרון. כל צעד כביסה בוצעו הגדרה חרוזים מגנטיים PBS / BSA על מערבל סיבוב 5 דקות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים פעם באמצעות 1 מ&quot;ל של תמיסת טריס / BSA חיץ. הסר טריס / פתרון BSA. ביצוע שלב זה על ידי הגדרת חרוזים מגנטיים טריס / BSA חיץ על סיבוב מערבל עבור 4 שעות ב 37 ° C *; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים פעם באמצעות 1ml של רענון (נשמר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס) PBS / פתרון BSA חיץ. הסר PBS / BSA פתרון. ביצוע שלב זה הגדרה חרוזים מגנטיים PBS / BSA חיץ על סיבוב מערבל עבור 5min בטמפרטורת החדר; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה צעד להסיר את כל נוזל כביסה להוסיף 1 מ&quot;ל PBS חיץ NaN + 3 + BSA כנוזל האחסון; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חרוזים מגנטיים מצופה ב 4 ° C (שים לב חרוזים מגנטיים מצופה יציבים לפחות 2 חודשים 4 ° C); </li></ol> * לצורך זה מערבל ממוקם בתנור מצויד עם חור המאפשר הכניסה של כבל אספקת החשמל. לחלופין המיקסר יכול להיות ממוקם בחדר thermostated על 37 ° C. 7) Sample הכנה מיצוי 25 גרם של דגימת טחון (אוכל ארוחת בוקר או דגנים לתינוק) אנחנוighed לצנצנת בלנדר והוציא עם 100 מ&quot;ל של אצטוניטריל / פתרון המים (86/14) במשך 3 דקות במערבל במהירות גבוהה. לאחר צנטריפוגה ב 4000 סל&quot;ד (3,000 גרם) במשך 5 דקות, 8 מ&quot;ל של supernatant נלקחו מטוהרים עם טור Mycosep, 4 מ&quot;ל של לחלץ את ניקו יובשו תחת זרם חנקן. דגימות יבשים יכולים להיות מאוחסנים ב -30 ° C עד מספר חודשים. 8) הכינון מחדש לדוגמא ארוחת בוקר דגנים מחדש את ארוחת הבוקר לחלץ דגנים יבשים (מזון דגנים מבוסס שהופנתה לצריכה מבוגר) עם 40 מ&quot;ל של PBS pH 7.4. בדרך זו מדגם עם ריכוז של רעלן שווה להגביל המשפטי אמור (200 ng / g) ייתן בשלב המדידה אות נופלת באמצע טווח העבודה. מזון לתינוקות מחדש מזון יבש לחלץ תינוק (אוכל דגני בוקר המבוססים שהופנתה לצריכה התינוק) עם 4 מ&quot;ל של PBS. בדרך זו מדגם עם ריכוז של רעלים שווה להגביל המשפטי אמור (20-25 ng / g) ייתן בשלב המדידה אות נופלת באמצע טווח העבודה.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

השימוש נוגדנים כמו בדיקה הכרה biomolecular ראה השימוש הנרחב בטכנולוגיות חישה; מתודולוגיות גילוי immunochemical, כגון ELISAs ו MEIAs, נמצאים, כיום, בין פלטפורמות השתמשו ביותר מיושם במעבדות רבות 7. בעוד הגישות הללו להשיג רגישות וספציפיות חריגי?...

ריאגנטים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן זרחתי dihydrogen </td><td> סיגמא </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodium פוספט מימן </td><td> סיגמא </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 anhydrous </td><td> סיגמא </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DEA (99.5%) </td><td> סיגמא </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> סיגמא </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> סיגמא </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> טריס [hydroxymethyl]-aminomethane </td><td> סיגמא </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> סיגמא </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> אלדריץ&#39; </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Naphthyl disodium מלח פוספט </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> חלב פתרון ריפרף חסימת - ללא חלב יבש שומן </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 מצומדות עם KLH (Hemocyanin Keyhole צלחית), פתרון מניות (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH המצומד הושג על ידי שיטת-CDI שם חופשי OH-לקבוצות על המיקום 3 ו -4 על רעלן HT-2 היו מופעלים על ידי N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ואת הפעלת HT-2 היה רעלן בואו להגיב aminogroups של החלבון (KLH) כדי ליצור הצמדה carbammate יציב. </td></tr><tr><td> נוגדן הנקרא משניים: אנטי עכבר IgG (H + L) מסוס, מצומדות עם phosphatase אלקליין, בריכוז 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </td><td> וקטור מעבדות </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 רעלן </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חרוזים מגנטיים: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> ריכוז 2 x 10 9 חרוזים / ml. </td></tr></table> פתרונות <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> הכנה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שנאגרו מלוחים פוספט (PBS), pH 7.4 </td><td> להמיס 0.20 גרם של אשלגן כלורי, 0.20 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט, 1.16 גרם של מימן disodium פוספט ו 8.00 גרם של נתרן כלורי ב 900 מ&quot;ל מים </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine חיץ, DEA, 0.97 מ &#39;+ 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 </td><td> ממיסים 0.0476g של MgCl 2 anhydrous ו 7.3.59 גרם של KCl ב ~ 300 מ&quot;ל מים. לאחר פירוק להוסיף 51 מ&quot;ל של ה-DEA (99.5%). התאם ל-pH 9.8 עם HCl (6 ז). מדולל 500 מ&quot;ל מים. </td><td></td></tr><tr><td> חיץ borate, 0.1 מ &#39;, pH 9.5 </td><td> להמיס 3.09 גרם של H 3 BO 3 ב ~ 300 מ&quot;ל של מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 9.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל 500 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </td><td></td></tr><tr><td> טריס חיץ, 0.2 מ &#39;, pH 8.5 </td><td> להמיס 3.85 גרם של טריס [hydroxymethyl]-aminomethane ב 100 מ&quot;ל מים. התאם ל-pH 8.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל ל 200 מ&quot;ל מים. </td><td></td></tr><tr><td> טריס חיץ + BSA פתרון (0.1%), pH 8.4 </td><td> ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ&quot;ל של חיץ טריס pH 8.4. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> PBS חיץ + tween ® 0.05% </td><td> ממיסים 0.250 גרם tween 20 ב 500 מ&quot;ל של הכינו בעבר PBS חיץ, pH 7.4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS חיץ + BSA פתרון 0.1% </td><td> ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ&quot;ל של PBS חיץ, pH 7.3. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> PBS חיץ BSA + 0.1% + NaN 3 0.02% </td><td> ממיסים 0.050 גרם ו - 0.010 BSA של NaN 3 ב 50 מ&quot;ל של PBS חיץ, pH 7.3. </td><td> אחסון סולution </td></tr><tr><td> אנזימתי המצע </td><td> ממיסים 0.010 גרם של מלח 1-Naphthyl סודיום פוספט ב 100 מ&quot;ל של pH חיץ DEA 9.8. לעטוף את הבקבוק היטב בנייר אלומיניום. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> חלב פתרון ריפרף חסימת </td><td> הוסף 0.20 גר &#39;של סופג חוסם כיתה ללא שומן חלב יבש (Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה&quot;ב) עד 200 מ&quot;ל של PBS חיץ pH 7.3. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 מניות פתרון </td><td> להמיס 10 מ&quot;ג של הבקבוקון trichothecene HT-2 רעלן, ב 10 מ&quot;ל של אצטוניטריל לתת פתרון עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </td><td> פצל את הפתרון הזה לתוך לשימוש יחיד aliquots של 30 מ&quot;ל ולאחסן אותם בפחות מ -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 עבודה פתרון סטנדרטי </td><td> פיפטה 20 מ&quot;ל של תמיסת HT-2 מניות רעלן לתוך מ&quot;ל 2 מכויל בקבוק volumetric ו לדלל עם אצטוניטריל להשיג פתרון HT-2 עבודה המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של רעלן trichothecene. </td><td> פתרון זה אמור להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 calibrant פתרונות עבודה </td><td> לדלל את הפתרון HT-2 תקן עובדים (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) להכין פתרון calibrant עובד 100 ng / ml. מדולל HT-2 עובדים פתרון calibrant 100 ng / ml להכין עבודה פתרונות calibrant הריכוזים הבאים 0 (ריק), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים טריים ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 מצומדות עם KLH </td><td> פצל את HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) לתוך לשימוש יחיד aliquots של μl 350. </td><td> חנות aliquots ב -30 ° C. </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי ספציפי </td><td> מדולל 1:350 (v: v) את ריכוז מניות (1.383 מ&quot;ג / מ&quot;ל) של נוגדנים חד שבטיים ב PBS להשתמש בשלב התחרות </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. 10 מניות מ&quot;ל נוגדן פתרון PBS עבור נפח סופי של 3.5 מ&quot;ל, הם מספיק כדי לנתח 17 תקנים ו / או דוגמאות. </td></tr><tr><td> נוגדן תווית משני </td><td> אנטי עכבר IgG (H + L) מצומדות עם phosphatase אלקליין הוא מדולל 1:100 (v: v) ב-PBS להשתמש בשלב התחרות. </td><td> 100 μl נוגדן מניות פתרון PBS עבור נפח סופי של 10 מ&quot;ל, הם מספיק כדי לנתח 25 תקנים ו / או דוגמאות. פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. </td></tr></table> מנגנון <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> חלקיקים מגנטיים מרוכז: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens מכשיר </td><td> PalmSens </td><td> מסופק עם PalmSens לייט, כבל חיבור טורי מחשב נייד ו Mux תוכנה אפשרויות </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens מרבב </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> שמונה Mux ערוץ מגע חשמלי </td><td> עבודת יד </td><td></td></tr><tr><td> רצועת עם שמונה אלקטרודות מסך מודפסים (SPES) </td><td> עבודת יד </td><td></td></tr><tr><td> תמיכה תוכנן במיוחד עבור רצועת אלקטרודות </td><td> עבודת יד </td><td> כולל 8 מגנטים ניאודימיום שכל אחד מהם ממוקם מתחת לפני השטח כל אלקטרודה העבודה של SPE </td></tr><tr><td> Microliter pipettes מכויל </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Stirrer מגנטי וברים ומערבבים. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית כוסות (100, 50, 20 מ&quot;ל). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נפחית צלוחיות (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ו 2ml Eppendorf צינורות. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> פלקון ™ שפופרות של 5 מ&quot;ל ו - 15 מ&quot;ל. </td><td> בז </td><td></td></tr><tr><td> מעבדה וורטקס מערבל </td><td></td><td> אין להשתמש במיקסר מערבולת כדי resuspend חרוזים מגנטיים מצופה HT2-KLH או מקושרים עם שרשרת החיסונית כדי למנוע denaturing חלקים proteic </td></tr><tr><td> מעבדה תנור או חדר thermostated </td><td></td><td> בחרו תנור מסוגלים לשמור על טמפרטורה של 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays הם אלטרנטיבה חוקית ועד יקר יותר זמן רב כמותי HPLC או GC 1, 2 שיטות לאיתור הקרנת mycotoxins מסוכנים מצרכי מזון. בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד לפברק ולחקור אנזים אלקטרוכימיים תחרותי assay immunomagnetic המקושרים המבוססים על שימוש של חרוזים מגנטיים תמיכה מוצקה עבור שרשרת immunochemical 3 ואלקטרודות מסך מודפס חישה פלטפורמה. השיטה שלנו שואפת לקבוע את הסכום הכולל של HT-2 ו-T-2 רעלים, mycotoxins השייכת למשפחת trichothecenes ושל דאגה רבה לבריאות האדם 4. השימוש שיבוט נוגדן עם תגובתיות צלב של 100% כלפי HT-2 ו-T-2 מאפשרת לזהות בו זמנית הן רעלים עם רגישות דומה 5. הצעד הראשון של assay שלנו היא הצעד ציפוי שבו אנו לשתק HT2-KLH רעלן המצומד על פני השטח של חרוזים מגנטיים. אחרי צעד חסימה, הכרחי כדי למנוע אי - קליטה ספציפיות, תוספת של נוגדנים חד שבטיים מאפשר תחרות בין משותקת HT-2 ו חינם HT-2 או T-2 להציג במדגם או מומס בתמיסה סטנדרטית. בסוף שלב התחרות, כמות נוגדנים חד שבטיים קשור משותקת HT-2 יהיה ביחס הפוך לכמות רעלן בפתרון המדגם. נוגדנים משני שכותרתו עם phosphatase אלקליין (AP) משמש כדי לחשוף את מחייב בין הנוגדן הספציפי משותקת HT-2. צעד המדידה הסופית מתבצעת על ידי הטלת aliquot ההשעיה חרוז מגנטי, המתאים פתרון מדגם מסוים / רגיל, על פני השטח של האלקטרודה המסך המודפס עבודה; חרוזים מגנטיים הם משותקים ומרוכז באמצעות מגנט ממוקם בדיוק מתחת מסך מודפס אלקטרודה. אחרי שתי דקות של דגירה בין חרוזים מגנטיים מצע עבור AP, המוצר האנזימטית הוא זוהה על ידי Voltammetry דיפרנציאלי Pulse (DPV) באמצעות מכשיר נייד (PalmSens) יכול גם ליזום באופן אוטומטי eight מדידות תוך הפסקה של כמה שניות.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K Views.  University of Rome, Tor Vergata. פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

Video: ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.