وقد تم دعم البحوث التي أجراها والاس جائزة مؤسسة حاء كولتر الوظيفي المبكر في البحوث بالحركة. بفضل تيم اندروز ، طب أمراض الدم / الأورام ، للمساعدة في جمع عينات من الدم. كما شكر للدكتور سام ولهوسان ، وتدفق الخلوي الأساسية ، وجيمس غراهام براون مركز السرطان ، للمساعدة في تشغيل عينات التدفق الخلوي.

الجزء 1. ميكروفلويديك جهاز تلفيق تم إنشاء قالب السيليكون الرئيسي للجهاز تحلل باستخدام تقنيات الطباعة بصفائح معدة ضوئيا ميكروفلويديك القياسية مع المعدات في جامعة لويزفيل غرف الأبحاث [1]. وقد استخدم أوتوكاد (أوتوديسك ، وشركة ، وسان رافائيل ، كاليفورنيا) لإنشاء قناع الشفافية (Fineline التصوير ، كولورادو سبرينغز ، أول أكسيد الكربون) لإنشاء النسخ المتماثلة السلبية للقنوات. كانت ملفقة الجهاز ميكروفلويديك تحلل من القالب الرئيسي السيليكون باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة مع بولي الاستومر (dimethylsiloxane) (PDMS ؛ داو كورنينغ ، ميدلاند ، ميتشيغن). تم الإفراج عن الاستومر مع القنوات منسوخة ، واللكم والثقوب وصول القناة مع إبرة عيار 20 (أجزاء صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا). وكان الرهينة لا رجعة فيه الرقاقة PDMS إلى شريحة الزجاج عبر البلازما الأكسجين واختبار التجريب. الجزء 2. بروتوكول لتشغيل جهاز تحلل بعد مفتعلا الجهاز ميكروفلويديك واختبارها ، والتجارب مع تحلل كرات الدم الحمراء على استعداد للبدء. تفاصيل المقطع التالي على البروتوكول للجهاز ميكروفلويديك. 2.1 جمع العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 4 مل من عينة دم من الوريد المرفقي وسيطة ، وعلى المنوال الساعد الأمامي للمريض مع الهيبارين وتخثر في اثنين 2 مل vaccutainers أعلى الخضراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل first أنبوب 2 مل كما أنه يحتوي على خلايا بطانية ناضجة فكها (ايجابيات كاذبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الأنبوب الثاني لمزيج مع الهيبارين في الدم عن طريق تحول صعودا وهبوطا ، حفظ فورا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من الدم إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف. عملية عينة الدم فورا (في غضون ساعة واحدة من جمع). </li></ol> 2.2 الجهاز ميكروفلويديك مع رئيس PBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على جهاز ميكروفلويديك المستعبدين من الزجاج. الصحافة تناسب الأنابيب وصول (أجزاء صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا) بقطر أكبر قليلا في مداخل ومنافذ (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق إبرة حقنة عيار 30 (أجزاء صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا) إلى الأنبوب في كل من المنافذ ، وتوفير واجهة الماكرو إلى الجزئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 1 مل مع 1X PBS وتأكد للتخلص من الفقاعات التي عبها إبرة المحقنة. توصيل PBS محملة حقنة 1 مل 1 إلى مدخل على الجهاز ميكروفلويديك. دفع الحقنة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X بلطف باليد حتى حل ينبع من مدخل 2 ، ومن ثم المشبك فورا مدخل 2 مع مقطع مكتب الموثق القياسية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في دفع السوائل PBS 1X حتى تصل إلى الميناء منفذا للجهاز على microfluidics. مرة واحدة في حل ينبع من مأخذ ، المشبك الأنبوب مع مخرج آخر مقطع الموثق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في دفع حقنة 1 مل حتى 1X PBS يتدفق من مدخل 3 ، والمشبك 3 مدخل الميناء مع مكتب آخر مقطع الموثق. هو الآن على microfluidics معبي الجهاز بالكامل. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تخطيطي يظهر منافذ الجهاز عن حلول ومخرج منها. 2.3 التحضير للمضخات المحاقن والحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمعايرة مضخات اتبع الخطوات التالية : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحقنة هارفارد مضخة كبيرة (جامعة هارفارد ، والدكتوراه 22/2000 الجزء # 702000) : تعيين التكوين قطرها إلى 22.5 مم ، معدل التدفق 600 ميكرولتر / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمضخة صغيرة الحقنة هارفارد (جامعة هارفارد ، بالاضافة الى الجزء بيكو # 702213) : تعيين التكوين إلى قطرها 4،61 ملم ، ومعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة ملء واحدة 30 مل مع الماء منزوع الأيونات معقمة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال سحب الحل مباشرة من الأنبوب مخروطية 50 مل. (تسمية المحقنة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الحقنة الثانية مع 30 مل 2X الفوسفات مخزنة الملوحة بارافورمالدهيد (PBS) 2 ٪ (PFA) باستخدام الإجراء المذكورة في الخطوة 9. (تسمية المحقنة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 1 مل مع 1X PBS من aliquots المخزنة في أنابيب مخروطية 15 مل ، وذلك باستخدام الإجراء المذكورة في الخطوة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط 30 مل ماء منزوع الأيونات حقنة لمدخل 2 و 30 مل حقنة PBS 2X إلى مدخل 3 (تأكد من فخ ر ارتداء فقاعات في أنابيب أو الجهاز على microfluidics). إزالة المشبك من 2 و 3 مداخل ومنافذ أنابيب. توصيل 1X PBS حقنة 1 مل في مدخل 1. تجنب إدخال فقاعات عن طريق ملء الإبرة المحاقن مع السائل ، والذي يربط بين حقنة وعبها إبرة حقنة للتخلص من الفقاعات. </li></ol> تحلل كرات الدم الحمراء 2.4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل مجموعة من الحقن على مضخات هارفارد الصحيح كما هو مبين أدناه : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المحاقن منهما 30 مل (واحد يحتوي على عقيمة ، غير المتأينة المياه وغيرها مع PBS 2X ، PFA 2 ٪) معا على ضخ حقنة كبيرة هارفارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حقنة 1 مل (التي تحتوي على 1X PBS) على مضخة صغيرة حقنة هارفارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب منفذا في جامع النفايات (50 مل أنبوب مخروطي الشكل الذي يسمى ثaste). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة كبيرة حقنة هارفارد (المحاقن مع 30 مل) والسماح لها الترشح لدقيقة واحدة. (تأكد من عدم وجود فقاعات وجود تسرب في الجهاز أو في الأنبوب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة صغيرة حقنة هارفارد والسماح لها يرشح نفسه لدقيقة إضافية. (تأكد من عدم وجود فقاعات وجود تسرب في الجهاز أو في الأنبوب). توقف المضخات. الجهاز على microfluidics الآن جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حقنة 1 مل تحتوي على 1X PBS من مضخة صغيرة حقنة هارفارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على عينة من الدم ، وملء محقنة 1 مل مع 0.05 مل من 1X PBS عقيمة دون محاصرة أي فقاعات. المقبل ، وملء المحقنة مع 0.5 مل من الدم تم الحصول عليها من الأنبوب إيبندورف. (وسوف حقنة 1 مل تحتوي الآن على الحجم النهائي من 0.55 مل من الدم و1X العازلة PBS). ملاحظة : حافظ على رأسي بينما ملء محقنة لتجنب اختلاط PBS 0.05 مل مع الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة تحتوي على توصيل الدم إلى مدخل 1 وجبل المحقنة بعناية (تجنب دفع الدم عبر الأنابيب في الجهاز) على مضخة صغيرة حقنة هارفارد (هي التي شنت المحقنة إلى مضخة عمودية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنابيب مخرج من أنبوب النفايات ووضع أنبوب الطرد المركزي نظيفة 50 مل في مكانها ووضعها على دلو من الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على ضخ حقنة كبيرة هارفارد الأولى والسماح لها الترشح ل1 دقيقة. بدء جمع عينة من مأخذ الطرد المركزي في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مضخة صغيرة حقنة هارفارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في عينة من الدم في حقنة 1 مل قد سافر تماما من خلال الجهاز ، ووقف كل من المضخات. هذا ينبغي أن يستغرق حوالي 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينة التي تم جمعها لمدة 5 دقائق في 350 XG في درجة حرارة الغرفة مع قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف إزالة غيض من خلال وضع ماصة في الجانب الآخر من الكريات البيضاء. كما طاف إزالة أكبر قدر ممكن ، والحطام الخلية الحمراء خاصة ، دون الإخلال بيليه الأبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend العينة في 1 مل من تدفق العازلة (1X PBS ، 1 ٪ BSA [البقري ألبومين المصل] ، 2 ٪ PFA) بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge العينة التي تم جمعها لمدة 5 دقائق عند 4 XG في درجة حرارة الغرفة. استخدام نفس الدقة قبل لإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend العينة في 1 مل من تدفق العازلة التي vortexing. </li></ol> 2.5 التحضير لتحليل تدفق cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل العينات باستخدام التدفق الخلوي ، إضافة ميكرولتر من 100 عينة لتدفق أنبوب الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لميكرولتر 100 من العينة إضافة الضد المحدد (ضمان التركيز الصحيح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاحتضان عينة لمدة 30 دقيقة في 40 C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين مع تدفق العازلة قبل التدفق الخلوي. الخطوة تتضمن غسل مضيفا 250 ميكرولتر من تدفق العازلة ، vortexing ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 XG ، وإزالة السائل بدوره طاف مع واحدة من أنبوب التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 250 ميكرولتر من تدفق العازلة. نموذج جاهز للتحليل التدفق الخلوي. </li></ol> ممثل النتائج تم تشغيل كامل الدم من خلال الجهاز ميكروفلويديك تحلل وبروتوكول آخر لمعالجة والتخلص من الكريات الحمراء وتعميم تخصيب خلايا الأنوية (CNCs). وسوف تسفر عن نتائج مثالية التدفق الخلوي نظيفة مؤامرة مبعثر مع السكان CNC منفصلة. عرض أدناه في الشكلين 2 و 3 المقارنات مؤامرة مبعثر لعينة من الدم الكامل دون تحلل كرات الدم الحمراء وكريات الدم الحمراء مع تحلل بواسطة بروتوكول ميكروفلويديك مع محاور على النحو المبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) الخفيفة. ويمكن ملاحظة أن بروتوكول تخصيب ميكروفلويديك هو ضروري للحصول على التدفق الخلوي نظيفة مؤامرة مبعثر. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تدفق مؤامرة مبعثر الخلوي من عينة دم كامل دون تحلل كرات الدم الحمراء مع FSC ومحاور التعاون بين بلدان الجنوب. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. مؤامرة التدفق الخلوي مبعثر تعميم الخلايا الأنوية مع تحلل كرات الدم الحمراء ميكروفلويديك صفت من قبل السكان مع FSC ومحاور التعاون بين بلدان الجنوب. المنطقة 1 (الحمراء) تمثل الخلايا الليمفاوية ، المنطقة 2 (الخضراء) تمثل حيدات ، والإقليم 3 (الأزرق) يمثل المحببة ، والمنطقة 4 (الأرجواني) لم يتسم. ازالة الحطام بواسطة ماصة الخلايا الحمراء في البروتوكول المهم أيضا عند الضرورة. أدناه في الشكل (4) هو مؤامرة مبعثر تبين وجود فائض من حطام خلية حمراء. وإن لم يكن يعكر مؤامرة مبعثر كما في الشكل 2 ، ويجب حساب واحد للأحداث وأضاف بسبب الحطام كرات الدم الحمراء خلال تحليل البيانات. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. مؤامرة مبعثر التدفق الخلوي تصور حطام خلية حمراء ، ينظر إليها على أنها كتلةالأحداث في المنطقة 5 (السماوي). وبالنسبة لبعض خلايا تلطيخ علامات النمط الظاهري توليد الأجسام المضادة أيضا نتائج مميزة. في الأرقام التالية هي البقع النمط الظاهري الضد لمدة 3 السكان الكريات البيض متميزة : الخلايا الليمفاوية ، وحيدات ، والمحببة. الشكل 5 يصور السكان اللمفاويات تآمر مع محاور وCD3 CD4. وترد وحيدات والمحببة في الأرقام 6-7 مع محاور على النحو FSC مقابل CD14 وCD66b ، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. مؤامرة مبعثر الخلوي تصور تدفق الخلايا الليمفاوية مع CD3 CD4 والفؤوس. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. مؤامرة مبعثر التدفق الخلوي تصور وحيدات مع FSC محاور CD14. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7. مؤامرة مبعثر تدفق الخلوي تصور المحببة مع FSC CD66b والفؤوس.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

وقد افاد الآلي تحلل الدم ميكروفلويديك البروتوكول. ضمن البروتوكول هي الخطوات الحاسمة الجدير بالذكر. في القسم P.2.1 ، فمن المهم أن تجاهل فيال الدم الاولى التي جمعت وكانت العينة تحتوي على خلايا بطانية ناضجة فكها بوصفها ايجابيات كاذبة. أيضا التأكد من تشغيل عينة من الدم في ?...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

في هذا التقرير هو مفصل في البروتوكول الآلي للحصول على جهاز ميكروفلويديك الدم تحلل. تعميم خلايا الأنوية (CNCs) ، بما في الكريات البيضاء وخلايا بطانة الأوعية الدموية ، وتوفير منصة مثالية للحصول على وضع محدثة عن حالة المناعي للفرد. بروتوكول ميكروفلويديك يسمح لتخصيب CNCs دون فقدان الخلية عينة انتقائية وتقلب بسبب إعداد المستخدم بوساطة الخطوات. لفترة وجيزة ، ويتضمن البروتوكول تصنيع الجهاز ، وجمع العينات ، إعداد الجهاز ، وتشغيل الدم من خلال غرفة ميكروفلويديك. داخل الجهاز هو مختلط الدم بسرعة كاملة مع الماء منزوع الأيونات لنحو 10 ثانية في 50 ميكرون × 150 قناة ميكروفلويديك ميكرون. في هذا الوقت هي lysed الكريات الحمراء تمتد بسبب ظروف ناقص التوتر. هياكل متعرجة على الجزء السفلي من القناة ضمان خلط دقيق والتعرض للخلايا في بيئة ثابتة. يتم إرجاع الخلايا المتبقية لظروف متساوي التوتر في الخروج من الجهاز ، باستخدام بارافورمالدهيد ثابتة 2 ٪ ، وطرد لفصل كرات الدم الحمراء من الحطام CNCs ، وعلقت في تدفق العازلة للتلوين وتحليلها من جانب التدفق الخلوي. تظهر النتائج نظيفة المؤامرات مبعثر تدفق الخلوي مع السكان CNC المحفوظة. أهمية هذا الجهاز والبروتوكول يأتي في دراسة وفهم الأمراض المرضية عن طريق التحليل للسكان باستخدام الحاسب الآلي. وبالتالي ، فإن تظاهر الأتمتة والفعالية والبساطة للبروتوكول ميكروفلويديك.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells at JoVE.com

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

وقد تم تطوير جهاز ميكروفلويديك الآلي لتعميم الأنوية تخصيب الخلية من الدم المحيطي عبر تحلل كرات الدم الحمراء التي تضمن عزل عينة ذات جودة عالية من دون خسارة الخلية.

تحلل الدم ميكروفلويديك الآلي بروتوكول لتخصيب اعارة خلايا الأنوية

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Views.  University of Louisville. وقد تم تطوير جهاز ميكروفلويديك الآلي لتعميم الأنوية تخصيب الخلية من الدم المحيطي عبر تحلل كرات الدم الحمراء التي تضمن عزل عينة ذات جودة عالية من دون خسارة الخلية.

Video: Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

تخصيب خلايا NK من دم الانسان مع مجموعة من تقنيات RosetteSep StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

عزل خلايا CD4+ خلايا تي و "تحليل لتعميم" مساعد تي الحبيبي (كتفه) "خلية مجموعات فرعية" من 6-لون "الدم الطرفية استخدام التدفق الخلوي"

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

القياس الكمي للحمض النووي الخاص بالخنزير في الدم لنموذج زراعة Xenotransplantation

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...