La investigación ha sido apoyado por el Premio Wallace H. Coulter Carrera Fundación principios de la investigación traslacional. Gracias a Tim Andrews, Hematología / Oncología Pediátrica, para ayudar con la recolección de muestras de sangre. También gracias al Dr. Sam Wellhausen, Core Citometría de flujo, James Graham Brown Cancer Center, en busca de ayuda con el funcionamiento de las muestras de citometría de flujo.

Parte 1. Fabricación de dispositivos de microfluídica Un molde maestro de silicio del dispositivo de microfluidos lisis fue creado usando técnicas de fotolitografía con el equipo en la Universidad de Louisville sala blanca [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) se utilizó para generar una máscara de transparencia (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) para crear réplicas negativas de los canales. El dispositivo de microfluidos lisis fue fabricado a partir del molde maestro de silicio mediante técnicas litográficas suave con el elastómero de poli (dimetilsiloxano) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). El elastómero con los canales replicados fue puesto en libertad, y los agujeros fueron perforados canal de acceso con una aguja de calibre 20 (piezas pequeñas, Miramar, FL.). La oblea PDMS fue unido irreversiblemente a un portaobjetos de vidrio mediante plasma de oxígeno y la prueba de la experimentación. Parte 2. Protocolo para el funcionamiento de dispositivos de lisis Después de que el dispositivo de microfluidos ha sido fabricado y probado, los experimentos con lisis de los eritrocitos está listo para comenzar. La siguiente sección detalla el protocolo para el dispositivo de microfluidos. 2.1 Recolección de muestras <ol><li> Recoger 4 mililitros de muestra de sangre de la vena cubital mediana, en la vena del antebrazo anterior del paciente con heparina como anticoagulante en dos 2 ml superior vaccutainers verde. </li><li> Deseche los 2 primeros ml del tubo, ya que contiene desalojados células maduras endoteliales (falsos positivos). </li><li> Volver a suspender el segundo tubo para mezclar con la sangre de la heparina girando hacia arriba y abajo, guardar inmediatamente en hielo. </li><li> Transferir 1 ml de sangre a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Proceso de la muestra de sangre de inmediato (dentro de una hora de recogida). </li></ol> 2.2 El primer dispositivo de microfluidos con PBS <ol><li> Obtener un dispositivo de microfluidos unido al vidrio. Press-fit tubos de acceso (piezas pequeñas, Miramar, FL) de diámetro ligeramente mayor en las entradas y salida (Figura 1). </li><li> Adjunte una aguja de la jeringa de calibre 30 (piezas pequeñas, Miramar, FL) a la tubería en cada una de las entradas de aire, proporcionando la macro a la interfaz de micro. </li><li> Llene una jeringa de 1 ml con PBS 1X y asegúrese de deshacerse de las burbujas accionando la aguja de la jeringa. Conecte el PBS-cargado una jeringa a la entrada de uno en el dispositivo de microfluidos. Empuje la jeringa que contiene el PBS 1X suavemente con la mano hasta que la solución fluye de entrada 2, e inmediatamente después la abrazadera de entrada 2 con un clip de oficina carpeta estándar </li><li> Seguir impulsando la PBS 1X hasta que el líquido llega al puerto de salida del dispositivo de microfluidos. Una vez que la solución sale de la toma de corriente, sujete el tubo de salida con otro clip de encuadernación. </li><li> Seguir impulsando la jeringa de 1 ml hasta que el PBS 1X flujos de entrada 3, y la abrazadera de la entrada de 3 puertos con otro clip de Cuaderno de Office. El dispositivo de microfluidos está totalmente preparado. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema del dispositivo muestra las entradas de las respectivas soluciones y toma de corriente. 2.3 Preparación de las bombas de jeringa y solución de <ol><li> Para calibrar las bombas siga estos pasos: <ol class="lalpha"><li> Para la gran bomba de jeringa de Harvard (Harvard, PHD parte 22/2000 # 702000): Establece la configuración de diámetro de 22,5 mm, caudal 600 l / min. </li><li> Para la pequeña bomba de jeringa Harvard (Harvard, Pico Además Parte # 702213): Establece la configuración de diámetro de 4,61 mm, caudal 20 l / min. </li></ol></li><li> Llene una jeringa de 30 ml con agua destilada estéril. Esto se puede lograr mediante la retirada de la solución directamente del tubo cónico de 50 ml. (Etiqueta de la jeringa) </li><li> Llene una jeringa de 30 segundos con 2X tampón fosfato-salino (PBS), un 2% de paraformaldehído (PFA), utilizando el procedimiento descrito en el paso 9. (Etiqueta de la jeringa) </li><li> Llene una jeringa de 1 ml con PBS 1X a partir de las alícuotas almacenadas en los 15 ml tubos cónicos, mediante el procedimiento descrito en el paso 9. </li><li> Conecte la jeringa de 30 ml de agua desionizada a la entrada 2 y los 30 ml de PBS 2X jeringa a la entrada 3 (asegúrese de que usted no las burbujas de trampa t en el tubo o dispositivo de microfluidos). Retire la abrazadera de las entradas de 2 y 3 y el tubo de salida. Conecte el 1X PBS una jeringa en la entrada 1. Evitar la introducción de burbujas mediante la cumplimentación de la aguja de la jeringa con el líquido, la conexión de la jeringa, y agitando la aguja de la jeringa para eliminar las burbujas. </li></ol> 2.4 lisis de los eritrocitos <ol><li> Ajuste todas las jeringas en la correcta bombas de Harvard como se indica a continuación: <ol class="lalpha"><li> Ponga los dos 30 ml jeringas (con alto contenido estéril, agua desionizada y la otra con 2X PBS, 2% PFA), junto a la bomba de jeringa grande de Harvard. </li><li> Ponga la jeringa de 1 ml (con 1X PBS) en la bomba de jeringa pequeña de Harvard. </li><li> Coloque el tubo de salida en un recipiente para residuos (50 ml tubo cónico que se denomina wAste). </li></ol></li><li> Encienda la bomba de jeringa grande de Harvard (con 30 jeringas ml) y se deja correr por un minuto. (Asegúrese de que no haya burbujas y no hay fugas en el dispositivo o en la tubería). </li><li> Encienda la bomba de jeringa pequeña de Harvard y se deja correr por un minuto más. (Asegúrese de que no haya burbujas y no hay fugas en el dispositivo o en la tubería). Detener las bombas. El dispositivo de microfluidos ya está listo para ser utilizado. </li><li> Retire la jeringa de 1 ml que contiene 1X PBS de la bomba de jeringa pequeña de Harvard. </li><li> Después de obtener una muestra de sangre, llenar la jeringa de 1 ml con 0,05 ml de PBS estéril 1X sin atrapar las burbujas. A continuación, llenar la jeringa con 0,5 ml de sangre obtenida del tubo Eppendorf. (La jeringa de 1 ml contiene ahora un volumen final de 0,55 ml de la sangre y el tampón PBS 1X.) Nota: Mantenga la jeringa vertical, mientras que el llenado para evitar la mezcla de la PBS 0,05 ml de la sangre. </li><li> Conecte la jeringa que contiene la sangre a la entrada 1 y montar la jeringa con cuidado (evitar empujar la sangre a través del tubo en el dispositivo) en la bomba de jeringa pequeña de Harvard (la jeringa se monta vertical en la bomba). </li><li> Retire el tubo de salida del tubo de drenaje y poner un limpia tubo de 50 ml centrífuga en su lugar y lo puso en un cubo de hielo. </li><li> Encienda la bomba de jeringa grande Harvard primero y deje que funcione durante 1 minuto. Comenzar a recoger la muestra de la desembocadura en el tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Encienda la bomba de jeringa pequeña de Harvard. </li><li> Una vez que la muestra de sangre en la jeringa de 1 ml por completo ha viajado a través del dispositivo, deje de ambas bombas. Esto debería tomar unos 20 minutos. </li><li> Centrifugar la muestra recogida durante 5 minutos a 350 xg a temperatura ambiente con el de freno. </li><li> Aspirar el sobrenadante mediante la colocación de punta de la pipeta en el lado opuesto de la bolita blanca. Eliminar la mayor cantidad de residuos posible sobrenadante, las células, especialmente de color rojo, sin perturbar el precipitado blanco. </li><li> Resuspender la muestra en 1 ml de buffer de flujo (1X PBS, BSA al 1% [albúmina de suero bovino], 2% PFA) pipeteando arriba y hacia abajo. Transferir la muestra a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Microcentrífuga de la muestra recogida durante 5 minutos a 4 xg a temperatura ambiente. Use la misma precisión que antes para eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender la muestra en 1 ml de solución tampón de flujo de vórtice. </li></ol> 2.5 Preparación para el análisis de citometría de flujo <ol><li> Para el análisis de muestras mediante citometría de flujo, añadir 100 ml de muestra a un tubo de citometría de flujo. </li><li> Para el l 100 de muestra, añadir anticuerpos específicos (asegurar la concentración correcta). </li><li> Que la muestra de incubar durante 30 minutos a 40 C. </li><li> Lavar dos veces con tampón de flujo antes de la citometría de flujo. Paso de lavado incluye la adición de 250 l de buffer de flujo, agitación, centrifugación durante 5 minutos a 350 xg, y eliminar el sobrenadante con el líquido a su vez uno de los tubos de citometría de flujo. </li><li> Resuspender el precipitado en 250 l de tampón de flujo. Muestra está lista para el análisis por citometría de flujo. </li></ol> Resultados representante La sangre entera se ha ejecutado a través del dispositivo de microfluidos y el protocolo de lisis post-procesamiento, librar de los eritrocitos y el enriquecimiento que circulan las células nucleadas (CNC). Ideal resultados dará lugar a una citometría de flujo limpio diagrama de dispersión con poblaciones separadas CNC. Se muestra a continuación en las figuras 2 y 3 son las comparaciones gráfico de dispersión de una muestra de sangre entera sin lisis de los eritrocitos y con lisis de los eritrocitos por el protocolo de microfluidos con ejes como dispersión frontal (FSC) versus dispersión lateral (SSC) de luz. Se puede observar que el protocolo de enriquecimiento de microfluidos es necesario obtener una citometría de flujo limpio diagrama de dispersión. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La citometría de flujo diagrama de dispersión de la muestra de sangre entera sin lisis de los eritrocitos con el FSC y SSC ejes. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La citometría de flujo diagrama de dispersión de las células circulantes en núcleos lisis de microfluidos eritrocitos marcados por las poblaciones con el FSC y SSC ejes. Región 1 (rojo) representa los linfocitos, la Región 2 (verde) representa los monocitos, la Región 3 (azul) representa a los granulocitos, y la región 4 (morado) aún no se ha caracterizado. Eliminación de restos de glóbulos rojos con una pipeta en el protocolo también es importante cuando es necesario. A continuación en la Figura 4 es un diagrama de dispersión que muestran un exceso de residuos de glóbulos rojos. A pesar de no empañar el diagrama de dispersión como en la figura 2, uno debe tener en cuenta los acontecimientos añadido debido a los escombros de eritrocitos durante el análisis de datos. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La citometría de flujo diagrama de dispersión que muestra restos de glóbulos rojos, visto como un grupode los acontecimientos en la Región 5 (azul). Tinción de las células de ciertos marcadores de anticuerpos fenotipo también va a generar resultados característicos. En las figuras siguientes son las manchas de anticuerpos fenotipo de tres poblaciones de leucocitos diferentes: los linfocitos, monocitos y granulocitos. La Figura 5 muestra las poblaciones de linfocitos trazado de ejes CD3 y CD4. Monocitos y granulocitos se muestran en las figuras 6-7 con ejes como el FSC frente a CD14 y CD66b, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. La citometría de flujo diagrama de dispersión que representan linfocitos CD3 y con ejes de CD4. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. La citometría de flujo diagrama de dispersión que representa los monocitos con el FSC y ejes CD14. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Citometría de flujo diagrama de dispersión que representa granulocitos con el FSC y ejes CD66b.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

Un sistema automatizado de protocolo de microfluidos lisis de sangre ha sido reportado. Dentro del protocolo son pasos críticos dignos de mención. En la sección P.2.1, es importante desechar el frasco de sangre recogen la primera vez que la muestra contiene desalojados células endoteliales maduras que actúan como falsos positivos. También asegúrese de ejecutar la muestra de sangre una hora después de la recolección. Cebado del dispositivo de microfluidos en el apartado P.2.2, es importante para librar al princi...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

En este informe, el protocolo de un sistema automatizado de dispositivo de microfluidos lisis de sangre se detalla. Distribución de células nucleadas (CNC), incluyendo los leucocitos y las células endoteliales, proporcionan una plataforma ideal para un estado actualizado sobre el estado inmunitario de un individuo. El protocolo permite a los microfluidos para el enriquecimiento de la CNC, sin pérdida selectiva de células y la variabilidad de preparación de muestras, debido a los pasos mediada por el usuario. En pocas palabras, el protocolo incluye la fabricación de dispositivos, recolección de muestras, la configuración del dispositivo y la ejecución de la sangre a través de la cámara de microfluidos. Dentro del dispositivo de sangre entera se mezcla rápidamente con agua desionizada durante aproximadamente 10 segundos en un canal de 50 micrones x 150 micrones de microfluidos. En este tiempo los eritrocitos se lisan lapso debido a las condiciones hipotónicas. Estructuras de espina de pescado en la parte inferior del canal que se mezcle bien y la exposición de las células a un medio ambiente constante. Las células restantes se devuelven a condiciones isotónicas a la salida del dispositivo, fijo con paraformaldehído al 2%, se centrifuga para separar los residuos de eritrocitos de CNC, y suspendido en buffer de flujo para la tinción y análisis por citometría de flujo. Los resultados muestran el flujo de los diagramas de dispersión limpia citometría con poblaciones CNC salvo. Importancia de este dispositivo y el protocolo se presenta en el estudio y la comprensión de la patogénesis de la enfermedad mediante el análisis de las poblaciones de CNC. Por lo tanto, la automatización, la eficacia y la simplicidad del protocolo de microfluidos son demostrados.

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Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Un dispositivo de microfluidos automatizado fue desarrollado para la circulación de enriquecimiento de células nucleadas de sangre periférica mediante lisis de los eritrocitos que garantiza el aislamiento de la muestra de alta calidad sin pérdida de células.

Automatizada de sangre de microfluidos Protocolo de lisis para el Enriquecimiento de la circulación las células nucleadas

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K vistas.  University of Louisville. Un dispositivo de microfluidos automatizado fue desarrollado para la circulación de enriquecimiento de células nucleadas de sangre periférica mediante lisis de los eritrocitos que garantiza el aislamiento de la muestra de alta calidad sin pérdida de células.

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Enriquecimiento de las células NK a partir de sangre humana con el Kit de RosetteSep de Tecnologías de la StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Investigación

Biología

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocolo para el uso de gen Set enriquecimiento análisis para identificar el modelo Animal adecuado para la investigación traslacional

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...