واستنادا إلى تكنولوجيا microfluidic، فإن عزل وتوصيف CTCs من خلايا الدم العادية لا تتطلب استخدام مؤشرات بيولوجية محددة CTC، ومتوافقة مع ثقافة الخلية. يسهل هذا البروتوكول معدلًا مرتفعًا من استخراج CTC ، ويوفر تحليلًا cytological واسع النطاق لـ CTCs ، من خلال تقييم الخصائص الخلوية الخبيثة. إن التعبير PD-L1 من قبل CTCs له قيمة تنبؤية في إدارة سرطان الرئة.
تحسين الكشف عن استخدام هذا الاختبار يمكن أن تعزز إدارة أفضل للمرضى على المدى الطويل. ويشمل التطبيق الآخر لهذا البروتوكول الكشف عن الانحرافات الجينية باستخدام FISH، أو إجراء تحليل نسخي على CTCs، فضلا عن عزل الخلايا الجنينية الأصل لدى الأمهات. (إنّها ستُظهر الإجراء ستكون (جولي بالاندييه، تقنيّة من مختبرنا
لتخصيب الخلايا الورمية التي تسبق التحليل، قم أولاً بجمع 7.5 ملليلتر من الدم في أنبوب EDTA البوتاسيوم، والحفاظ على العينة تحت الانفعالات اللطيفة لتجنب ترسب الخلايا والتخثر. في غضون ست ساعات من جمع، واستخدام ماصة المصلية تحت خزانة سلامة الميكروبيولوجية، لنقل ما يصل إلى 7.5 ملليلتر من الدم كله إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر الطرد المركزي، والطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق في 1600 مرة G، في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الطرد المركزي، استخدم ماصة نقل لجمع جزء البلازما دون إزعاج معطف بافي، وتمييع البلازما مع حجم مكافئ من برنامج تلفزيوني، تصل إلى 7.5 ملليلتر.
بعد ذلك، قم بإضافة احتياطي خلايا الدم الحمراء إلى عينة الدم، إلى حجم نهائي من 30 ملليلتر، وعكس بلطف أنبوب جمع الدم ثلاث مرات، قبل وضع الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإزالة بعناية جميع ما عدا آخر أربعة إلى خمسة ملليلتر من افراط. استخدام ميكروبيبيت مصفاة لإزالة عظمى المتبقية، واستخدام p1000 micropette مع طرف مرشح لإضافة ملليلتر واحد من عازلة resuspension أسفل جدار الأنبوب.
لتجنب إدخال الفقاعات، resuspend بيليه الخلية مع pipetting لطيف، حتى العينة متجانسة. عندما تم إعادة تعليق بيليه، إضافة ثلاثة ملليلتر إضافية من عازلة resuspension إلى جدار الأنبوب، دون إدخال فقاعات، وخلط بلطف الخلايا مرة أخرى. للجهاز اللولبي microfluidic تعميم تخصيب الخلايا السرطانية، أولا تحميل رقاقة جديدة حلزونية microfluidic على الجهاز، وتحميل واحد أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر فارغة في كل من منافذ المدخلات والمخرجات.
انقر فوق رئيس الوزراء لرئيس الجهاز microfluidic دوامة لمدة ثلاث دقائق. إزالة أنابيب المدخلات والمخرجات في نهاية الدورة. تحميل عينة الدم resuspended في منفذ الإدخال، وتحميل أنبوب مخروطي 15 ملليلتر واضحة في منفذ الإخراج.
ثم انقر فوق تشغيل، وحدد البرنامج الثالث لبدء برنامج تخصيب الخلايا الورمية 31 دقيقة تعميم. في نهاية الدورة نقل أنبوب الإخراج إلى جهاز الطرد المركزي، واستخدام ماصة المصلية ملليلتر خمسة لإزالة جميع ما عدا آخر ملليلترين من عظمى. ثم استخدام micropipette لإزالة جميع ما عدا آخر 100 ميكرولترات من سوبرنات.
لتلوين الفلوروسين المناعي، عد الخلايا في مقياس الدم، وتمييع العينة المخصب إلى واحد مرة عشر إلى خمس خلايا لكل 100 ميكرولترات من 0.2٪ المضادة للربط تركيز الحل. بعد ذلك ، استخدم مسحة قطنية غارقة في 50 ميكرولترات من محلول مضاد للربط لترطيب كفاف غرفة العينة ، ووضع شريحة زجاجية من البوليليسين في غرفة العينة. إغلاق الغرفة، وماصة صعودا وهبوطا ثلاث مرات لمعطف تلميح micropipette مع الحل الملزم قبل resuspending العينة في آخر 100 ميكرولترات من عظمى.
نقل حل الخلية إلى غرفة العينة وstospin العينة في جهاز طرد مركزي مخصص في 400 دوران في الدقيقة لمدة أربع دقائق، في تسارع منخفض. في نهاية الطرد المركزي، ضع معزل السيليكون حول منطقة الترسيب واترك الشريحة جافة تحت خزانة أمان ميكروبيولوجية لمدة دقيقتين، ثم قم بإصلاح عينة cytospun مع 100 ميكرولترات من 4٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها ثلاثة غسيل دقيقتين مع 200 ميكرولتر من PBS لكل غسل، في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، كتلة أي ملزمة غير محددة مع حضانة 30 دقيقة في منع الكاشف في درجة حرارة الغرفة، تليها وضع العلامات مع 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة من الفائدة.
ضع الشريحة المسماة في طبق بتري 100 في 15 ملليلتر على قطعة من الورق الماص مبللة بمليلترين من الماء المعقم ، ووضع الطبق مغلقًا ، عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ، محميًا من الضوء. في صباح اليوم التالي، وغسل العينة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وجبل العينة مع 10 ميكرولترات من حل تركيب مناسبة وزلة غطاء زجاجي. ثم ختم زلة الغطاء مع طلاء الأظافر واضحة.
لتصوير عينات السيتوسبون، قم بتحميل الشريحة على مجهر فلوري مستقيم مع منصة مزودة بمحركات X Y، وحدد هدفًا 20x والقنوات المناسبة وفقًا للفلوروفوريس المستخدمة في وضع العلامات على الأجسام المضادة. قم بتشغيل مصباح الزئبق وتكيف المجهر والبرامج المرتبطة به مع تبادل إطلاق النار شبه التلقائي. عندما يكون المصباح جاهزًا، في قائمة الاستحواذ، حدد القنوات الأربع، وحدد وقت التعرض، وحدد البلاط لمسحه ضوئيًا.
انقر فوق التجانبات، والتجربة المتقدمة، وحدد المنطقة التي تريد مسحها ضوئيًا. ثم اضبط التركيز على الشاشة، ثم انقر فوق بدء التجربة. في نهاية التجربة، قم بتصدير ملفات TIF لكل قناة، وبالتحديد قم بتسمية الملف لتضمين العينة وعدد المرات والصبغة وعدد المربعات الفرعية.
لتحليل الصور، افتح برنامج تحليل الصور من موقع المعهد العريض، وانقر فوق ملف، خط أنابيب من ملف، وتحليل أربع قنوات CTC. إسقاط الملفات في قائمة الملفات، وتحديث البيانات الأولية لتجميع الملفات حسب الإطارات المتجانبة. ثم انقر فوق تحليل الصور لفتح ملف جدول البيانات المقابلة لمعلمات قياس كثافة.
بدون بروتوكول إزالة التلوث الأمثل ، لوحظ تلوث بكتيري مرتفع في ثقافات الأنسجة من خطوط الخلايا A549 المخصب بعد 24 ساعة فقط ، مما تسبب في الموت والتغيرات في الخلايا الخلوية في الخلايا الكهنية. في المقابل، بعد بروتوكول التنظيف، يتم الحصول على الخلايا A549 الحية في الثقافات 2D بعد 10 ساعة من زراعة الأنسجة وإزالة المتوسطة، في ظل ظروف ثقافة 3D، وداخل عينات المريض. باستخدام مقول مناعي فلوروسنت تلطيخ المقايسة أو مقايسة تلوين مناعية على الشرائح المغلفة بوليليسين مع cytospin ، يمكن ملاحظة تمييز واضح في عدد النوى التي تم تعدادها بين المقايستين.
دون خطوة cytospin ، من الصعب التمييز بين خلايا الدم البيضاء من الخلايا السرطانية ، وذلك بسبب الخطوط العريضة الضبابية في اخطط الخلايا غير السيتوسين. هنا يمكن ملاحظة نتائج تمثيلية مختلفة من عينات المرضى المختلفة ، مع تحديد العدد المتبقي من خلايا الدم البيضاء على وجه الخصوص على أنها متغيرة بقوة ، وتعتمد على عينة الدم بأكملها. ولوحظ أيضاً تباين كبير في الخلايا السرطانية المنتشرة دون الفئات السكانية التي تم الحصول عليها.
يتم تحديد كل خلية على cytospin من قبل برنامج تحليل الصور، وتمكن من تتبع الخلية، يدويا لتأكيد النتائج حسب الضرورة. وفي الواقع، أظهر تحليل تجريبي وجود توافق بين التعداد اليدوي وتعداد برامجيات تحليل الصور. يعد إعداد طبق بيتري الرطب المصمم في المنزل لتهجين الأجسام المضادة للبروتين أمرًا بالغ الأهمية ، حيث لا يزال الجهاز رطبًا بما فيه الكفاية طوال وقت الحضانة بأكمله.
