وأيد هذا العمل من قبل وكالة أبحاث السلوفيني مع المشروع Z2 - 9229 - P2 وبرنامج 0249. هذا الفيديو يمثل المواد التكميلية عن &quot;تقنيات Electroporation القاعدة والعلاج&quot; ورشة عمل علمية ودورة الدراسات العليا ، نظمت كل سنتين في كلية الهندسة الكهربائية في جامعة ليوبليانا ، سلوفينيا.

الجزء الأول : الخطوات الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذه التجربة تم استخدام خلية مبيض الهامستر الصيني الخط (CHO - K1). والخلايا في غرف مطلية الثاني مختبر تيك (2 الآبار ، 4 سم 2 لكل منهما) (Nalge نونك وألمانيا) في الخلايا ~ 0.7x10 5 / مل في HAM - F12 مستنبت تستكمل مع 8 ٪ مصل العجل الجنين ، 0.15 ملغ / مل L - الجلوتامين ، 16 ملغ / مل جنتاميسين (جميع من سيغما الدريخ ، Steinheim ، ألمانيا) ، والوحدات 200 / مل Crystacillin (شركة بليفا ، زغرب ، كرواتيا) ، وحضنت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تكون مطلية على الخلايا # 1 ينزلق الغطاء الزجاجي (0،13-0،16 مم) ، المغلفة مع مادة لاصقة مثل متعدد الليزين الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في المتوسط ​​ثقافتهم. حضانة دائم 2 إلى 4 ساعات غلة الخلايا التي لا تزال كروية تقريبا ، ولكن يرتبط بقوة إلى السطح مع جزء صغير من الغشاء بهم. بدلا من ذلك ، بعد 16 إلى 20 ساعة من الحضانة ، وترد بشكل كامل على سطح الخلايا ولها أشكال أكثر تعقيدا ، ولكن معظمها لا يزال غير تقسيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزون 10 مم حل ثنائي ANEPPS - 8 (Invitrogen ، يوجين ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية) وذلك بإضافة 843 ميكرولتر من DMSO (سيغما الدريخ ، Steinheim وألمانيا) إلى 5 ملغ من الصبغة في القارورة Invitrogen الأصلي. التي يمكن تخزينها في حل الأسهم في الثلاجة في درجة مئوية 4 لأشهر عدة. قبل البدء في التجارب ، والاحماء الحل حتى تذوب بلورات DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون بعض خطوط الخلايا تتطلب استخدام pluronic لتخفيف الصبغة التأسيس في غشاء الخلية. ويمكن شراء الأسهم Pluronic في حل 20 ٪ في DMSO (F - 127 ، Invitrogen ، يوجين ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، أو محلول المخزون من نفس التركيز ويمكن حل أعدتها pluronic في DMSO. ويمكن تخزين محلول المخزون من pluronic في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> الجزء الثاني : تحميل الخلايا مع ثنائي ANEPPS - 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 3 ميكرولتر من 10 ملي دي - 8 - ANEPPS و 2.5 ميكرولتر من pluronic 20 ٪ في 1 مل من التعديل سبينر (الكالسيوم المنضب الإصدار) من SMEM متوسطة الأساسية الدنيا (المتوسطة أو M8167 M4767 ، سيغما الدريخ ، Steinheim ، ألمانيا ) في أنبوب 1.5 مل إيبندورف. هذه الغلة &quot;حل تحميل&quot; التي تحتوي على ما يقرب من 30 ميكرومتر دي - 8 - ANEPPS و 0.05 ٪ من pluronic. لأنواع الخلايا الأخرى ، يمكن استخدام وسائل الاعلام ثقافتهم الأصلية بدلا من SMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الثقافة المتوسطة ، في قاعة مختبر تيك مع الحل التحميل. نقل إلى غرفة الثلاجة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. عند هذه الدرجة ، إلى حد كبير هو استيعاب للصباغة من خلال غشاء البلازما الكبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التلوين ، وغسل بلطف الصبغة مرتين إلى ثلاث مرات مع SMEM النقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك 1.5 مل من SMEM في الغرفة. </li></ol> الجزء الثالث : التجربة والحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالة لدينا زايس AxioVert 200 ، زايس ، وألمانيا) أن تكون مجهزة للنفط الهدف الغمر (x63 ، NA 1.4) ، وهو VisiCam مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron ، ألمانيا) ، واتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا تبريد ( 1280 ، Visitron ، ألمانيا). يتم الحصول على الصور مع MetaFluor 7.1.1 ومعالجتها في MetaMorph 7.1.1 (كل الأجهزة الجزيئية ، Downingtown ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولكن يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مشابهة يمكن اكتساب. تعيين الطول الموجي الإثارة في البرنامج إلى 490 نانومتر اقتناء واختيار مرشح مناسب لANEPPS الانبعاثات ، على سبيل المثال ، مرشح تمرير النطاق تركزت في نانومتر 605 (605/55m ، 565 DCXR مزدوج اللون ، كروما ، روكينجهام ، VT ، الولايات المتحدة). إذا مستوحد اللون غير متوفر ، ويمكن استخدام عامل تصفية الإثارة تركزت في 490 نانومتر بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغرفة مع الخلايا على خشبة المسرح المجهر ، موقف الأقطاب في الجزء السفلي من الغرفة وربطها مولد النبض. ينبغي أن متوسط ​​تغطية الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على سلامة الخلية والحد من التدفئة ، وينبغي أن يكون من نبض السعة منخفضة بما فيه الكفاية ومدتها قصيرة. في هذه التجربة يتم إنشاء مربع مع نبض V سعة 35 و 50 مللي ثانية مدتها (منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب electroporation) باستخدام امدادات التيار الكهربائي العاصمة ، وصنعت خصيصا جهاز التحويل والمعالجات التي تسيطر عليها. بدلا من ذلك ، مولد النبض التجارية ، مثل 33210A (اجيلنت ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) متصلة مكبر للصوت أو منشط التجارية ، مثل S88 (العشب ، وست وارويك ، ري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ويمكن استخدامها. يتم تسليم نبض لاثنين من أقطاب متوازية سلك حزب العمال / عير بقطر 0.8 ملم و 4 ملم المسافة بينهما ، وتهيئة المجال الكهربائي لحوالي 88 سم / V بين الأقطاب وΔΦ حمل. يوصف مجال توزيع الدقيق بين الأقطاب الكهربائية المستخدمة في هذه التجربة في مكان آخر [1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على خلايا الفائدة. تطبيق نبضة واحدة الكهربائية أو سلسلة من البقوليات. عن كل نبضة ، والحصول على صورتين مضان : واحد مباشرة قبل نبض (الصورة تحكم) ، ونبض واحد خلال (صورة النبض). نظرا لانخفاض استجابة دى ANEPPS - 8 ، والتغيرات في مضان يصعب تمييز بالعين المجردة ، وتصبح واضحة y. قلذ بعد المعالجة. يجب أن تكون متزامنة مع التسليم نبض الحصول على الصور ، والذي هو سمة من سمات برنامج الاقتناء. لتجنب photobleaching التدفئة وممكن ، ويمكن أن تقتصر على الإضاءة على مدة النبض. </li></ol> الجزء الرابع : معالجة الصور وتحليلها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور في برنامج MetaMorph. عن كل نبضة ، طرح الخلفية في السيطرة على السواء وصورة النبض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الخلية وتعيين المنطقة ذات الاهتمام بحيث يتوافق مع الغشاء. قياس كثافة مضان على طول هذه المنطقة في صورة رقابة والنبض ونقل القيم إلى جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن كل نبضة ، طرح بيانات التحكم من البيانات النبض ، وتقسيم النتيجة عن طريق التحكم في بيانات للحصول على التغيرات النسبية مضان. إذا تم تطبيق سلسلة من البقول ، ويمكن حساب متوسط ​​القيم النسبية للتغيرات مضان المقررة لكل نبضة للحصول على قياس أكثر موثوقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل التغيرات النسبية في مضان ΔΦ باستخدام منحنى المعايرة. ويمكن الحصول على تقدير تقريبي لهذا المنحنى من الأدب ، ولكن لزيادة الدقة ، وأنه لا بد من قياس لكل نمط معين. للخلايا والإعداد المستخدمة في هذه التجربة انخفاضا بنسبة 6 ٪ في مضان يتوافق مع زيادة بنسبة 100 في بالسيارات [2] ΔΦ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، مؤامرة الجهد كدالة لطول قوس النسبي في حزمة برامج الرسوم البيانية مثل اكسل (مايكروسوفت ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة) ، السيدة سيغما قطعة (Systat البرمجيات ، وشركة سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) ، أو المنشأ (OriginLab كورب ، نورثهامبتون ، MA ، الولايات المتحدة). ويمكن أيضا أن تكون ممهدة المنحنى باستخدام مرشح مناسب ، مثل تصفية المتوسط ​​المتحرك. </li></ol>

<ol>
	<li>Maz&#232;res, S., &#352;el, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklav&#269;i&#269;, D., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+invasive+contact+electrodes+for+in+vivo+localized+cutaneous+electropulsation+and+associated+drug+and+nucleic+acid+delivery.">Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery.</a> J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).</li><li>Pucihar, G., Kotnik, T., Vali&#269;, B., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+determination+of+transmembrane+voltage+induced+on+irregularly+shaped+cells.">Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells.</a> Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).</li><li>Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+voltage-gated+sodium-channel+blockers+by+electrical+stimulation+and+fluorescence+detection+of+membrane+potential.">Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential.</a> Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).</li><li>Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+electric+potentials+in+soma+and+neurite+membranes.">Distinct electric potentials in soma and neurite membranes.</a> Neuron. 13, 1187-1193 (1994).</li><li>Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+responses+of+transmembrane+potential+during+electric+field+stimulation+of+single+cardiac+cells.">Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells.</a> Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).</li><li>Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electropermeabilization+of+cell+membranes.">Electropermeabilization of cell membranes.</a> Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).</li><li>Sersa, G., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemotherapy+of+tumours.">Electrochemotherapy of tumours.</a> JoVE. 22, (2008).</li><li>Kotnik, T., Bobanovi&#x0107;, F., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+transmembrane+voltage+induced+by+applied+electric+fields+a+theoretical+analysis.">Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis.</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).</li><li>Schwan, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+tissue+and+cell+suspensions.">Electrical properties of tissue and cell suspensions.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).</li><li>Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+electrical+modeling+of+single+and+multiple+cells.">An approach to electrical modeling of single and multiple cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).</li><li>Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+studies+of+cell+response+to+ultrashort,+high-intensity+electric+fields+-+Implications+for+intracellular+manipulation.">Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation.</a> IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).</li><li>Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+membrane+potential+changes+induced+by+applied+electric+fields.">Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields.</a> Biophys. J. 50, 339-348 (1986).</li><li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. p. e. c. t. r. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=membrane+binding,+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes.">membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).</li><li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes:+measurement+of+membrane+potentials+induced+by+DC+and+AC+electric+fields.">Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields.</a> Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).</li><li>Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. . J. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+conductance+of+an+electroporated+cell+analyzed+by+submicrosecond+imaging+of+transmembrane+potential.">Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential.</a> Biophys. J. 59, 209-220 (1991).</li><li>Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+medium+and+membrane+conductance+on+the+amplitude+and+kinetics+of+membrane+potentials+induced+by+externally+applied+electric+fields.">Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields.</a> Biophys. J. 56, 121-128 (1989).</li><li>Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electric+properties+by+combined+patch+clamp+and+fluorescence+ratio+imaging+in+single+neurons.">Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons.</a> Biophys. J. 74, 48-53 (1998).</li><li>Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurements+of+membrane-potential.">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential.</a> Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).</li><li>Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometry+of+transmembrane+voltage-sensitive+fluorescent+dye+emission+in+hearts.">Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).</li><li>Pucihar, G., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-dependent+numerical+model+of+transmembrane+voltage+inducement+and+electroporation+of+irregularly+shaped+cells.">A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells.</a> IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).</li></ol>

ويمكن قياس الغشاء المستحث (عبر الغشاء) الجهد ، ΔΦ ، يكون من المهم في ضبط التجريبية المختلفة ، مثل الدراسات قنوات الغشاء الجهد مسور ، ونشر عمل محتمل ، تحفيز خلايا القلب ، أو خلية غشاء electroporation [3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7]. مع الخلية الأشكال البسيطة ، يمكن أن تحسب ΔΦ تحليلي. على سبيل المثال ، لخلية كروية ، تعطى عن طريق المعادلة ΔΦ شوان ليالي ، التي تنص على أن الجهد يتناسب مع شدة المجال وحجم الخلية ويلي الدالة جيب التمام على طول الغشاء [8 ، 9]. لمزيد من الأشكال خلية معقدة ، ويمكن أن تنحرف ΔΦ كبيرا من جيب التمام ، ويجب أن تحدد إما عدديا ، وذلك باستخدام جهاز كمبيوتر [2 ، 10 ، 11] ، أو تجريبيا ، وذلك باستخدام صبغة potentiometric [12 ، 13 ، 14 ، 15]. واحدة من الأصباغ potentiometric استخداما لهذا الغرض هي دي - 8 - ANEPPS (دي - 8 - بوتيل - الأميني النفثول - الاثيلين pyridinium - بروبيل سلفونات) ، صبغة سريع مع الإثارة وانبعاث أطياف تعتمد على الجهد الغشاء ، الذي يسمح الملاحظات موسع للتغيرات في ΔΦ على غشاء الخلية وقياس قيمته. في هذا الفيديو ، وتبين لنا مقاربة تجريبية لتحديد ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS. وقد وضعت الصبغة البروفيسور ليزلي لوف وزملاؤه [13 ، 14] في جامعة كونيتيكت ، وينتمي إلى فئة من الاستجابة السريعة الأصباغ. دي - 8 - ANEPPS هو nonfluorescent في الماء وتصبح الفلورسنت بقوة عندما يدمج في طبقة ثنائية المادة الدهنية في غشاء الخلية. أي تغيير في النتائج ΔΦ في تغيير توزيع تهمة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ والتغيرات المناظرة في ملف الطيفية وكثافة مضان الصبغة ل. كثافة مضان من دى ANEPPS - 8 يختلف نسبيا إلى تغيير ΔΦ ، واستجابة للصباغة خطي لالفولتية تتراوح بين -280 إلى +250 بالسيارات بالسيارات [4 ، 16]. تغييرات صغيرة نسبيا في مضان للصباغة ، تلوين الغشاء متفاوتا ، واستيعاب صبغ جعل دي - 8 - ANEPPS أقل ملاءمة للمقاييس مطلقة من الجهد الغشاء ، مثلا عنصرها يستريح ، على الرغم من وأفادت التقارير أيضا هذه الجهود [17]. هو عليه ، ومع ذلك ، ومناسبة لقياس التغيرات في الجهد الأكبر الغشاء ، مثل بداية الجهد المستحث في غشاء الخلايا nonexcitable تتعرض لمجالات كهربائية الخارجية [12 ، 13] ، أو إمكانات العمل في الخلايا منفعل [4 ، 5]. وإن لم تطبق هنا ، دي - 8 - ANEPPS كما يسمح تصميم ΔΦ بواسطة القياسات ratiometric من الإثارة مضان [18] أو الانبعاثات [19] ، مما يزيد من الحساسية للاستجابة ، ويقلل من الآثار المذكورة أعلاه. كما دي - 8 - ANEPPS البقع الغشاء ، يمكن أن تستخدم أيضا بوضوح كعلامة الغشاء [2]. واحدة من المآخذ على الصبغة هو أنه عرضة للphotobleaching ، بحيث يجب تجنب التعرض لفترات طويلة لضوء قوي. تتم معايرة الصبغة إما مع valinomycin (ط) ionophore البوتاسيوم ومجموعة من تركيزات مختلفة من البوتاسيوم المتوسط ​​الخارجية [2،18] ، أو (ب) التصحيح ، المشبك المشبك في وضع التيار الكهربائي [17]. أخيرا ، مع قياسات ΔΦ على الخلايا والخلايا كروية الأشكال أكثر تعقيدا ، والفيديو يوضح تأثير شكل الخلية على التوزيع المكاني للالسعة وΔΦ. وبالتالي لخلايا كروية ΔΦ قريب من جيب التمام ، وذلك بالاتفاق مع شفان المعادلة ، في حين لأكثر الأشكال تعقيدا الخلية التوزيع المكاني للΔΦ هو أكثر تعقيدا [20]...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>di-8-ANEPPS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3167</td>
<td>potentiometric fluorescent dye</td>
</tr>
<tr>
<td>pluronic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>potassium ionophore</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M8167 or M4767</td>
<td>Spinner modification of the Minimum Essential Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ham-F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N4888</td>
<td>culture medium</td>
</tr>
<tr>
<td>fetal calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>crystacillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pliva</td>
<td>625110</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G1397</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab-Tek II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>155379</td>
<td>chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>DC voltage supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elektro-Automatik</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microprocessor-controlled switcher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pt/Ir</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring the induced membrane voltage with di-8-anepps

وضع خلية في حقل كهربائي خارجي يؤدي إلى إعادة توزيع تهمة المحلية داخل وخارج الخلية في المنطقة المجاورة لغشاء الخلية ، مما أدى إلى الجهد عبر الغشاء. هذا الجهد ، ويسمى الغشاء الجهد المستحث (أيضا بفعل الجهد عبر الغشاء ، أو بفعل فرق الجهد عبر الغشاء) ويرمز لها ب ΔΦ ، موجود فقط طالما الحقل الخارجي موجودا. إذا كان الجهد يستريح موجودة على الغشاء ، والجهد المستحث تطغى (يضيف) على ذلك. باستخدام واحدة من الأصباغ الفلورية في potentiometric ، مثل ثنائي ANEPPS - 8 ، فمن الممكن لمراقبة التغيرات في ΔΦ على غشاء الخلية وقياس قيمتها noninvasively. دي - 8 - ANEPPS بقوة عندما يصبح الفلورسنت منضمة إلى طبقة ثنائية المادة الدهنية في غشاء الخلية ، مع تغير كثافة مضان يتناسب مع تغيير ΔΦ. هذا الفيديو يبين بروتوكول لقياس ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS وكما يوضح تأثير شكل الخلية على السعة والتوزيع المكاني للΔΦ.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS at JoVE.com

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

ووصف الجهد المستحث غشاء (ΔΦ) الخارجية الحقل الكهربائي يؤدي الى الجهد على غشاء الخلية. باستخدام الصبغة potentiometric دي - 8 - ANEPPS ، فمن الممكن لقياس ΔΦ noninvasively. هذا الفيديو يبين بروتوكول لقياس ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS.

قياس الفولتية المستحثة الأغشية مع ثنائي ANEPPS - 8

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

measuring-the-induced-membrane-voltage-with-di-8-anepps

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K Views.  University of Ljubljana. ووصف الجهد المستحث غشاء (ΔΦ) الخارجية الحقل الكهربائي يؤدي الى الجهد على غشاء الخلية. باستخدام الصبغة potentiometric دي - 8 - ANEPPS ، فمن الممكن لقياس ΔΦ noninvasively. هذا الفيديو يبين بروتوكول لقياس ΔΦ باستخدام دي - 8 - ANEPPS.

Video: Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

ال<em&gt; القيطم</em&gt; سيت قص مفتوحة الفازلين جاب الجهد المشبك تقنية مع التألق

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...