Эта работа была поддержана Словенский исследовательского агентства с проектом Z2-9229 и программу Р2-0249. Это видео представляет дополнительный материал для &quot;Электропорация основе технологий и методов лечения&quot; научно-практический семинар и аспирантуре, организованной два раза в год на факультете электротехники в университете Любляны, Словения.

Часть I: Предварительные шаги <ol><li> В этом эксперименте яичника китайского хомячка линии клеток (СНО-К1) используется. Клетки высевают в Lab-Tek II камеры (2 скважины, 4 см 2 каждый) (Nalge Nunc, Германия) при ~ 0.7x10 5 клеток / мл в HAM-F12 культуральной среде дополнен с 8% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,15 мг / мл L-глутамина, 16 мг / мл гентамицина (все от Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия), и 200 ед / мл Crystacillin (Плива, Загреб, Хорватия), и инкубировали в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Кроме того, клетки могут быть также высевают на # 1 стеклянная крышка скользит (0,13 до 0,16 мм), с покрытием сотовой клея, например полилизином. </li><li> Инкубируйте клетки в питательной среде. Инкубационный продолжительностью 2 до 4 часов дает клеткам, которые все еще примерно сферическую, но прочно прикреплены к поверхности с небольшой частью их мембраны. Кроме того, после 16 до 20 часов инкубации клетки полностью прикреплен к поверхности и более сложные формы, но большинство из них до сих пор не делиться. </li><li> Подготовка маточного раствора 10 мМ ди-8-ANEPPS (Invitrogen, Юджин, штат Орегон, США) путем добавления 843 мкл ДМСО (Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия) до 5 мг красителя в оригинальном флаконе Invitrogen. Маточный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Перед началом экспериментов, разогреть решение пока кристаллы ДМСО растворяются. </li><li> Некоторые клеточные линии могут потребовать использования плуроник, чтобы облегчить красителя включения в клеточные мембраны. Pluronic можно приобрести в 20% маточного раствора в ДМСО (F-127, Invitrogen, Юджин, штат Орегон, США), или маточный раствор той же концентрации могут быть получены путем растворения плуроник в ДМСО. Исходный раствор плуроник можно хранить при комнатной температуре. </li></ol> Часть II: Загрузка клеток с ди-8-ANEPPS <ol><li> Смешайте 3 мкл 10 мМ ди-8-ANEPPS и 2,5 мкл 20% плуроник в 1 мл модификации Spinner (кальций обедненный вариант) от минимально необходимого SMEM Medium (средний M8167 или M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия ) в 1,5 мл трубки Эппендорф. Это дает &quot;загрузки решение&quot;, содержащий около 30 мкМ ди-8-ANEPPS и 0,05% от плуроник. Для других типов клеток, их родной культуре средств массовой информации может быть использован вместо SMEM. </li><li> Замените питательной среде в лаборатории-Tek камера с загрузкой решение. Передача камере холодильника в течение 10 мин при 4 ° C. При этой температуре интернализации красителя через мембрану плазмы в значительной степени подавляется. </li><li> После окрашивания, аккуратно вымыть избыток красителя два-три раза с чистой SMEM. </li><li> Оставьте 1,5 мл SMEM в камере. </li></ol> Часть III: эксперимент и получение изображений <ol><li> Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Германия), оснащенных цель нефти погружения (x63, Н. А. 1.4), монохроматор (полихромные IV, Visitron, Германия) и охлаждением ПЗС-камеры (VisiCam 1280, Visitron, Германия). Изображения, полученные с MetaFluor 7.1.1 и обрабатываться в Метаморф 7.1.1 (как Molecular Devices, Downingtown, Пенсильвания, США), но другие подобные приобретение программного обеспечения также может быть использован. Установить длины волны возбуждения в приобретение программного обеспечения до 490 нм и выбрать подходящий фильтр выбросов ANEPPS, например, полосовой фильтр с центром в нм 605 (605/55m, дихроичных 565 DCXR, Chroma, Рокингем, VT, США). Если монохроматора отсутствует, возбуждение фильтр с центром в точке 490 нм может быть использован вместо. </li><li> Место камере с клетками на столике микроскопа, положение электродов в нижней части камеры и подключить их к импульсным генератором. Среда должна покрывать электроды. </li><li> Для поддержания жизнеспособности клеток и снижению отопления, импульс должен быть достаточно низкой амплитудой и короткой продолжительности. В этом эксперименте прямоугольный импульс с амплитудой 35 В и 50 мс (достаточно низко, чтобы избежать электропорации) генерируется с использованием источника постоянного напряжения и на заказ с микропроцессорным управлением переключатели устройства. Кроме того, коммерческие генератора импульсов, например, 33210A (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), подключенные к усилителю или коммерческих стимулятор, таких как S88 (Grass, West Warwick, RI, США), могут быть использованы. Импульс поступает на два параллельных Pt / Ir электродов проволоки с диаметром 0,8 мм и 4 мм расстояние между ними, создавая электрическое поле около 88 В / см между электродами и вызывающие ΔΦ. Точное распределение поля между электродами, используемые в настоящем эксперимент описан в [1]. </li><li> Найти клетки интерес. Применение одного электрического импульса или последовательности импульсов. Для каждого импульса, приобрести две флуоресцентные изображения: один непосредственно перед импульсом (контроль изображения), и один во время импульса (импульса изображения). Из-за низкой реакции ди-8-ANEPPS, изменения в флуоресценции трудно различить невооруженным глазом, и стало очевидно, ONLу после обработки. Импульса доставки должны быть синхронизированы с захвата изображения, которая является особенностью приобретения программного обеспечения. Чтобы избежать фотообесцвечивания и возможные отопления, освещения может быть ограничена продолжительность импульса. </li></ol> Часть IV: обработки и анализа изображений <ol><li> Открытые изображения в программном обеспечении Метаморф. Для каждого импульса, вычитание фона в обоих контроля и импульса изображения. </li><li> Выбрать ячейку и установить область интереса, так что он соответствует мембраны. Мера интенсивности флуоресценции по этому региону в образе управления и импульса и передачи значений в таблицу. </li><li> Для каждого импульса, вычесть контроль данных из импульсов данных, а полученный результат разделить на контроль данных для получения относительной флуоресценции изменения. Если последовательность импульсов применяется, значения относительных изменений флуоресценции определяется для каждого импульса может быть усреднены, чтобы получить более надежные измерения. </li><li> Преобразование относительной флуоресценции изменений в ΔΦ использованием калибровочной кривой. Приблизительную оценку этой кривой может быть получено из литературы, но и для более высокой точностью, он должен быть измерен для каждой конкретной установки. Для клеток и установки, используемые в настоящем эксперименте 6%-ное снижение флуоресценции соответствует 100 мВ увеличение ΔΦ [2]. </li><li> Наконец, участок напряжения в зависимости от относительной длины дуги в графический пакет программного обеспечения, таких как Excel (Microsoft Corp, Редмонд, штат Вашингтон, США), Sigma Участок (Systat Software Inc, Сан-Хосе, Калифорния, США), или Происхождение (OriginLab Corp, Нортхемптон, Массачусетс, США). Кривая может быть сглажены с помощью подходящего фильтра, таких, как движущиеся фильтр среднего. </li></ol>

<ol>
	<li>Maz&#232;res, S., &#352;el, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklav&#269;i&#269;, D., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+invasive+contact+electrodes+for+in+vivo+localized+cutaneous+electropulsation+and+associated+drug+and+nucleic+acid+delivery.">Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery.</a> J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).</li><li>Pucihar, G., Kotnik, T., Vali&#269;, B., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+determination+of+transmembrane+voltage+induced+on+irregularly+shaped+cells.">Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells.</a> Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).</li><li>Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+voltage-gated+sodium-channel+blockers+by+electrical+stimulation+and+fluorescence+detection+of+membrane+potential.">Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential.</a> Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).</li><li>Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+electric+potentials+in+soma+and+neurite+membranes.">Distinct electric potentials in soma and neurite membranes.</a> Neuron. 13, 1187-1193 (1994).</li><li>Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+responses+of+transmembrane+potential+during+electric+field+stimulation+of+single+cardiac+cells.">Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells.</a> Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).</li><li>Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electropermeabilization+of+cell+membranes.">Electropermeabilization of cell membranes.</a> Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).</li><li>Sersa, G., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemotherapy+of+tumours.">Electrochemotherapy of tumours.</a> JoVE. 22, (2008).</li><li>Kotnik, T., Bobanovi&#x0107;, F., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+transmembrane+voltage+induced+by+applied+electric+fields+a+theoretical+analysis.">Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis.</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).</li><li>Schwan, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+tissue+and+cell+suspensions.">Electrical properties of tissue and cell suspensions.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).</li><li>Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+electrical+modeling+of+single+and+multiple+cells.">An approach to electrical modeling of single and multiple cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).</li><li>Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+studies+of+cell+response+to+ultrashort,+high-intensity+electric+fields+-+Implications+for+intracellular+manipulation.">Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation.</a> IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).</li><li>Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+membrane+potential+changes+induced+by+applied+electric+fields.">Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields.</a> Biophys. J. 50, 339-348 (1986).</li><li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. p. e. c. t. r. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=membrane+binding,+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes.">membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).</li><li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes:+measurement+of+membrane+potentials+induced+by+DC+and+AC+electric+fields.">Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields.</a> Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).</li><li>Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. . J. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+conductance+of+an+electroporated+cell+analyzed+by+submicrosecond+imaging+of+transmembrane+potential.">Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential.</a> Biophys. J. 59, 209-220 (1991).</li><li>Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+medium+and+membrane+conductance+on+the+amplitude+and+kinetics+of+membrane+potentials+induced+by+externally+applied+electric+fields.">Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields.</a> Biophys. J. 56, 121-128 (1989).</li><li>Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electric+properties+by+combined+patch+clamp+and+fluorescence+ratio+imaging+in+single+neurons.">Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons.</a> Biophys. J. 74, 48-53 (1998).</li><li>Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurements+of+membrane-potential.">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential.</a> Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).</li><li>Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometry+of+transmembrane+voltage-sensitive+fluorescent+dye+emission+in+hearts.">Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).</li><li>Pucihar, G., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-dependent+numerical+model+of+transmembrane+voltage+inducement+and+electroporation+of+irregularly+shaped+cells.">A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells.</a> IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).</li></ol>

Измерения индуцированного мембраны (трансмембранный) напряжение, ΔΦ, может иметь важное значение в различных экспериментальных условиях, таких как исследования напряжения закрытого мембранных каналов, распространения потенциала действия, сердечной стимуляции клетки или клеточные мембраны электропорации [3, 4, 5, 6 , 7]. С помощью простой формы клетки, ΔΦ может быть вычислена аналитически. Например, для сферической клетки, ΔΦ задается уравнением с Шван, которая гласит, что напряжение пропорционально напряженности поля и размера ячейки и следует косинус вдоль мембраны [8, 9]. Для более сложных форм клетки, ΔΦ может значительно отклоняться от косинус и должен быть определен либо численно, с помощью компьютера [2, 10, 11], или экспериментально, с помощью потенциометрического красителя [12, 13, 14, 15]. Один из потенциометрического красители широко используются для этой цели является ди-8-ANEPPS (ди-8-бутил-амино-нафтил-этилен-пиридиния-пропил-сульфонат), быстро красителя с возбуждения и спектры излучения зависит от мембранного напряжения, , которая позволяет неинвазивным наблюдений вариаций ΔΦ на клеточной мембране и измерить его значение. В этом видео мы покажем, экспериментальный подход для определения ΔΦ с помощью ди-8-ANEPPS. Краситель был разработан профессором Лесли Лева и его коллеги [13, 14] в Университете Коннектикута и принадлежит к классу быстродействующих красителей. ди-8-ANEPPS является nonfluorescent в воде и становится сильно люминесцентные, когда она включает в липидный бислой клеточной мембраны. Изменения ΔΦ результатов в изменении внутримолекулярного распределения заряда и соответствующие изменения в спектральных профиль и интенсивность флуоресценции красителя в. Интенсивности флуоресценции ди-8-ANEPPS меняется пропорционально изменению ΔΦ; реакция красителя является линейной для напряжений в диапазоне от -280 мВ до +250 мВ [4, 16]. Относительно небольшие изменения флуоресценции красителя, неравномерное окрашивание мембраны, и красителя интернализации делают ди-8-ANEPPS менее пригоден для абсолютных измерений мембранного напряжения, например, его покоя компонентом, хотя такие усилия были также зарегистрированы [17]. Это, однако, подходит для измерения больших изменений в мембранных напряжений, таких как возникновение наведенного напряжения мембраны в nonexcitable клетки воздействию внешних электрических полей [12, 13], или потенциалы действия в возбудимых клеток [4, 5]. Хотя здесь не применяется, ди-8-ANEPPS также позволяет определить ΔΦ по логометрических измерения возбуждения флуоресценции [18] или излучения [19], что увеличивает чувствительность и снижает ответ вышеуказанных эффектов. Как ди-8-ANEPPS пятен мембраны, она также может быть использован ясно, как мембранный маркер [2]. Один из недостатков красителя том, что он склонен к фотообесцвечивания, так, что длительное воздействие сильного света следует избегать. Калибровка красителя производится либо с (я) калия валиномицина ионофором и набор различных концентрации калия во внешней среде [2,18], или (II), патч-зажим в режиме напряжения зажим [17]. Наконец, при измерениях ΔΦ на сферические клетки и клетки, более сложных форм, видео демонстрирует влияние формы клеток от амплитуды и пространственного распределения ΔΦ. Таким образом, для сферических клеток ΔΦ близка к косинус, в согласии с уравнением Шван, в то время как для более сложных форм ячейки пространственного распределения ΔΦ более сложной [20] ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>di-8-ANEPPS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3167</td>
<td>potentiometric fluorescent dye</td>
</tr>
<tr>
<td>pluronic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>potassium ionophore</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M8167 or M4767</td>
<td>Spinner modification of the Minimum Essential Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ham-F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N4888</td>
<td>culture medium</td>
</tr>
<tr>
<td>fetal calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>crystacillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pliva</td>
<td>625110</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G1397</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab-Tek II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>155379</td>
<td>chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>DC voltage supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elektro-Automatik</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microprocessor-controlled switcher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pt/Ir</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring the induced membrane voltage with di-8-anepps

Размещение клетки в внешнее электрическое поле вызывает перераспределение внутри местных заряд и вне клетки в непосредственной близости от клеточной мембраны, в результате чего напряжение на мембране. Это напряжение, называемое наведенное напряжение мембраны (также индуцированные трансмембранные напряжения, или индуцированных разница трансмембранного потенциала) и обозначается ΔΦ, существует только до тех пор, как внешнее поле присутствует. Если покоя напряжение присутствует на мембране, наведенного напряжения накладывает (добавляет) на него. Используя один из потенциометрического флуоресцентные красители, такие как ди-8-ANEPPS, можно наблюдать изменения ΔΦ на клеточной мембране и измерить его значение неинвазивно. ди-8-ANEPPS становится сильно люминесцентные при привязке к липидный бислой клеточной мембраны, с изменением интенсивности флуоресценции пропорциональна изменению ΔΦ. Это видео показывает протокол для измерения ΔΦ использованием ди-8-ANEPPS, а также демонстрирует влияние формы клеток от амплитуды и пространственного распределения ΔΦ.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS at JoVE.com

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Внешнее электрическое поле индуцирует напряжение на мембране клетки, называемые наведенного напряжения мембраны (ΔΦ). С помощью потенциометрического красителя ди-8-ANEPPS, можно измерить ΔΦ неинвазивно. Это видео показывает протокол для измерения ΔΦ использованием ди-8-ANEPPS.

Измерение наведенного напряжения Мембрана с Ди-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

measuring-the-induced-membrane-voltage-with-di-8-anepps

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K Views.  University of Ljubljana. Внешнее электрическое поле индуцирует напряжение на мембране клетки, называемые наведенного напряжения мембраны (ΔΦ). С помощью потенциометрического красителя ди-8-ANEPPS, можно измерить ΔΦ неинвазивно. Это видео показывает протокол для измерения ΔΦ использова...

Video: Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов Cut открыть Вазелин Gap Напряжение-зажим Техника С флуорометрии

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Изображений с плазменным Мембрана Деформации С pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Измерение глутатион-индуцированной кормления ответ в Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Основного состояния истощения суперразрешением изображений в клетках млекопитающих

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...