وأيد هذا العمل عن طريق منحة المعاهد الوطنية للصحة التي منحت لبروستر R. (1R01GM085290 - 01A1).

1.Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع بلازميد ترميز الغشاء الذي يستهدف البروتين الأخضر نيون (mGFP ، من باب المجاملة هارلاند ريتشارد) إلى تركيز 40 نانوغرام / مل. أعد بواسطة الحمض النووي linearizing البلازميد (mGFP/PCS2 + ، من باب المجاملة هارلاند ريتشارد) تنقية باستخدام الإعدادية ماكسي Qiagen كيت. ويفضل إضافة أحمر الفينول (مخفف 10/01 الحجم الكلي) إلى حل لتصور الحل. الحل إبقاء الحمض النووي على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope ، معايرة إبرة الحقن (ضربات 90mm الزجاج من الشعيرات الدموية العلمية Narishinge ؛ القط رقم NA - GD - 1) عن طريق مواءمة الإبرة على شريحة تخرج والتنصت بلطف جزءا من الإبرة حيث القطر 1μm باستخدام شفرة حلاقة نظيفة شفرة (للحصول على معلومات سرية من الحجم المناسب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل معايرة إبرة لحقن حجم المعروفة (2nl) ، وربط الإبرة إلى الأجهزة microinjection (PCI 100 Microinjector ؛ جهاز هارفارد) ، والجبهة ملء الإبرة مع 0.5μl من محلول يحتوي على أحمر الفينول والماء وضعها على قطعة من البارافين. ويمكن الاستغناء عن حل باستخدام دواسة القدم. ضبط ضغط الجيش الشعبي الكوري إلى 7 وتختلف الوقت (10msec 30msec) بحيث يستغرق 250 الدواسات الاستغناء 0.5μl من الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية مكان الإبرة معايرة على شريط من الشمع في ترطيب 100 مم طبق بتري. لترطيب الطبق ، ومكان Kimwipes الرطب حول حواف (وهذا يمنع التبخر من الحل في الإبرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام micropipette لتحميل 0.5 1μl من الحمض النووي في نهاية الإبرة (النهاية التي لم تكن محسوبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن وصلت إلى حل غيض الإبرة ، وربط نهاية الإبرة التي كانت تستخدم لتحميل لجهاز microinjection. ضبط الإعدادات على microinjector لتقديم ما يقرب من 2 NL / الحقن باستخدام دواسة القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القادم الزرد موقف والأجنة في وسط طبق بيتري مليئة متوسطة الأجنة (ألبوم 1.0 مل هانك # 1 ، 0.1 مل هانك الاسهم # 2 ، ألبوم 1.0 مل هانك في رقم 4 ، 95.9 مل DDH 2 O ، ألبوم 1.0 مل هانك و# 5 ، ألبوم 1.0 مل الطازجة وهانك # 6 ، استخدم حوالي 10 قطرات هيدروكسيد الصوديوم M 1 إلى 7.2 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في طور الأجنة إلى مرحلة المرجوة ، وقبضة بلطف المشيماء بالملقط الجميلة وضعه الإبرة في المنطقة المستهدفة عن طريق الحقن. لمجموعة واسعة التعبير mGFP ، وضخ الحمض النووي في صفار البيض أو السيتوبلازم في المرحلة 1cell. لتقييد حرية التعبير من mGFP إلى أصغر والمنطقة ، وحقن الحمض النووي في 4 (أو أكثر) مرحلة الخلايا إلى السيتوبلازم من خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على دواسة القدم لجهاز microinjection وتقديم ما يقرب من 2 NL ، وضمان أن يتم حقن صحيح الحل (مرئية بسبب إضافة أحمر الفينول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة بعناية من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع الأجنة في صحن بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتطوير اجنة في 28.5 درجة مئوية إلى المرحلة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate الأجنة بواسطة التقشير بلطف قبالة المشيماء باستخدام الملقط غرامة (إذا كان أصغر سنا من أجنة 24hpf ، dechorionating في طبق بتري الزجاج يزيد من معدل بقاء الأجنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشيماء فارغة من طبق بيتري باستخدام ماصة الزجاج. </li></ol> 2. التصوير mGFP المسمى المقاطع vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لنقل الأجنة في بارافورمالدهيد (4 ٪ تثبيتي في 1X الفوسفات حل العازلة (PBS). فيكس الأجنة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة في برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في طبق بتري و، وذلك باستخدام ملقط غرامة ، وإزالة صفار دون الإضرار بالجنين. إزالة صفار قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4 ٪ منخفضة ذوبان agarose في H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان agarose المصهور الى قالب من البلاستيك sectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لرفع الغرامة حقن الجنين من طبق بيتري ، ووضع وتوجيه في agarose. ينبغي وضع الجنين نحو نهاية واحدة من العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تصلب agarose ، استخدم أداة سطح مستو ، مثل ملعقة ، لإزالة كتلة agarose من العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الحد الادنى من كتلة agarose بشفرة الحلاقة بحيث يكون أكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من الصمغ السوبر إلى مرحلة vibratome ومكان كتلة agarose على ذلك (إلى جانب الكتلة التي كان استقر مع أسلاك شائكة ينبغي مواجهة الغراء). لsectioning أجنة متعددة ، يشن عدة agarose جزءا لا يتجزأ من العينات على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق المرحلة vibratome إلى vibratome (Vibratome ، وشركة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات من vibratome (إعدادات الشائعة : سرعة 3 ؛ سماكة - 50μm). إذا sectioning أجنة متعددة ، محاذاة كتل agarose على المسرح والتأكد من أن نصل يمر الجنين كلها ولكن ليس من خلال عرض كامل للكتل agarose (مثل تلك المقاطع المقابلة لنفس جنين ستبقى معا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 1X PBS في المرحلة vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الأجنة التقطيعةنيد ، إزالة كتلة agarose (ق) من المرحلة vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منفصلة بعناية كل قسم عن طريق قطع الجزء الخلفي من كتلة agarose (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة لتحديد الأجزاء المطلوبة والمكان الى صحن 1X متعددة مملوءة جيدا PBS (استخدام الآبار مختلفة عن الأجزاء المقابلة لأجنة مختلفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر لكل الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في وضع العلامات الأضداد ، على الرغم من الخطوات 19 23 ، لتعزيز mGFP التصوير (هذه الخطوة قد لا يكون ضروريا إذا كانت المقاطع المصورة في غضون يوم أو يومين من الإعداد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام علاج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الحل حظر في برنامج تلفزيوني 1X إلى كتلة غير محددة وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية (أرنب ، GFP ، Invitrogen القط رقم A11122) المخفف @ 1:200 في حل حظر على شاكر لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات (10 دقيقة ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة و 60 دقيقة ، ولكل منهما) في 1 ٪ BSA/1X PBS / 1 ٪ حل DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الأجسام المضادة الثانوية مع أقسام مناسبة في حل حظر لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات (10 دقيقة ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة و 60 دقيقة ، ولكل منهما) في 1 ٪ BSA/1X PBS / 1 ٪ حل DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج المقاطع مع دابي (0.1 ٪ في دابي PBS 1X 50ml ؛ Invitrogen القط رقم D1306) لمدة 30 دقيقة للصمة النوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة باستخدام المجهر مبائر. </li></ol> 3. يعيش التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate العيش والأجنة حقن 30 دقيقة قبل ان تصل الى مرحلة تنموية المرجوة. وضع الأجنة في حل المهدئة (0.01 ٪ Tricaine متوسطة في جنين) لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من agarose 1 ٪ على طبق زجاج 35mm الثقافة القاع (ماتيك ؛ الجزء رقم P35G - O - 20 - C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الحرارة الشعرية أكثر من اللهب لجعل 3 ثقوب في agarose (يمكن استخدام كائنات أخرى مثل micropipette نصائح لجعل الثقوب). ضمان عدم وجود agarose المتبقية في قعر حفرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بيتري مع متوسطة الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لوضع الجنين في حفرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، توجيه باستخدام ملقط الجنين الغرامة بحيث المنطقة المراد تصويره (رئيس الظهرية) في اتصال مع الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النقل بعناية طبق بيتري إلى مرحلة المجهر (وضع غطاء على طبق بيتري لمنع التبخر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما التصوير ، وضمان أن الأجنة في 28.5 درجة مئوية. </li></ol> 4. النتائج نحن هنا وصف نهج مباشرة لصورة واحدة في خلايا الأنبوب العصبي الزرد باستخدام التعبير الفسيفساء. على الرغم من الشفافية البصرية الجنين الزرد ، وجدنا أن يتعزز كثيرا من التصور الخلايا العصبية في الأجزاء التي تم الحصول عليها عبر استخدام vibratome. هذه المقاطع هي سميكة (50 ملم) مما يتيح للتصوير التمديد الخلوية من خلية معينة في طائرات التنسيق المختلفة باستخدام المجهر مبائر. وقد نشرت نتائج استخدام هذه المنهجية في أماكن أخرى 2 ، ولكن الصور ممثل الخلايا في الأنبوب العصبي للجنين WT (الشكل 1) وN - كادهيرين (N - CAD) وتقدم متحولة (الشكل 2). ويظهر الاخير ان الخلايا في المناطق الجانبية من لوحة العصبية في N - نذل المسوخ تفشل في توجيه سليم نحو خط الوسط (الشكل 2). على النقيض من هذا الوسم الفسيفساء ، والظهارة العصبية immunostaining مع علامة سطح الخلية عامة مثل بيتا catenin لا يسمح مورفولوجيا الخلايا الفردية أن تصور (الشكل 3). وقت التصوير انقضاء الأجنة الحية تكمل فسيفساء من العلامات الثابتة العينات ، مما يمكن من فهم أفضل للديناميات الخلوية التي تحدث أثناء neurulation. وكشف الفيلم أن الخلايا 1 WT بنشاط من أجل ترحيل خط الوسط من خلال توسيع نتوءات غشاء إعلامي المنحى. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> التعبير mGFP الرقم 1. في الأنبوب العصبي للجنين الزرد WT. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> التعبير mGFP الرقم 2. في الأنبوب العصبي للجنين الزرد N - كادهيرين. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تلطيخ المناعية B - catenin من الظهارة العصبية.

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish Practical approach series. , (2002).</li><li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish.">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos.">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في الختام ، وصفت تقنيات الوسم هنا يسمح للتحليل خلية واحدة من عمليات التخلق في الجنين الزرد. التركيز الأساسي لهذا البروتوكول هو على أساليب التصوير للخلايا المسمى في الأنبوب العصبي باستخدام mGFP تحت سيطرة أحد المروجين في كل مكان. وينبغي للتطبيقات إضافية من هذا التعبير ا...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1976">Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain</a>. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

الحلول <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 1 : 8.0 جرام كلوريد الصوديوم ، 0.4 غرام في 100 مل بوكل د O 2 H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 2 : 0.358 ز نا 2 هبو اللامائى 4 ، 0،60 ز KH 2 PO 4 في 100 مل O 2 DDH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 4 : 0،72 ز CaCl 2 في 50 مل O 2 DDH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك الاسهم # 5 : 1،23 ز MgSO 4 x7H 2 O في 50 مل د O 2 H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 العازلة الفوسفات X : 0.8 ٪ كلوريد الصوديوم ، بوكل 0.02 ٪ ، 0.02 M PO4 ، ودرجة الحموضة 7.3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجب الحل : 2 ٪ مصل الماعز العادية ، الأبقار مصل الزلال 1 ٪ (BSA) ، dimethysulfoxide 1 ٪ (DMSO) </li></ul>

labeling and imaging cells in the zebrafish hindbrain

المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر الفقاريات هي القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. في الأجنة الزرد ، وحقن من نتائج فحص الحمض النووي البلازميد الفسيفساء في التعبير ، والسماح لتصور واحد من الخلايا أو مجموعات صغيرة من الخلايا<sup&gt; 1</sup&gt;. نحن تصف كيف يمكن استخدام حقن الحمض النووي بلازميد ترميز غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء (mGFP) الخاضعة لسيطرة أحد المروجين للخلايا في كل مكان التصوير تمر neurulation. مركزية لهذا البروتوكول هي المنهجية للخلايا المسمى التصوير بدقة عالية في الفرعين ، وكذلك في الوقت الحقيقي. هذا البروتوكول ينطوي على حقن الحمض النووي في mGFP الأجنة الزرد الشباب. ثم تتم معالجة الأجنة لsectioning vibratome ، ووضع العلامات الأضداد والتصوير مع المجهر مبائر. بدلا من ذلك ، يمكن تصوير الأجنة الحية mGFP معربا عن استخدام الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر. لقد اعتدنا في السابق مباشرة لهذا النهج تحليل السلوكيات التي تدفع الخلايا العصبية تشكيل الأنبوب في منطقة الدماغ المؤخر الأجنة الزرد<sup&gt; 2</sup&gt;. الاستعدادات الثابتة يسمح لرؤية غير مسبوقة من الأشكال وتنظيم الخلايا في الأنبوب العصبي في حين يعيش التصوير استكمال هذا النهج تمكن من فهم أفضل للديناميات الخلوية التي تحدث أثناء neurulation.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain at JoVE.com

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر هو القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. نحن هنا وصف تقنية لوضع العلامات خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا في الأجنة الزرد كله مع غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء.

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

labeling-and-imaging-cells-in-the-zebrafish-hindbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  University of Maryland, Baltimore County. المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر هو القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. نحن هنا وصف تقنية لوضع العلامات خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا في الأجنة الزرد كله مع غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء.

Video: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...