لعزل سرداب الأمعاء الدقيقة للفئران ، استخدم شظايا مغسولة بشكل صحيح خمسة ملليمترات في خمسة ملليمترات من الأمعاء الدقيقة المعزولة. احتضان القطع في المضادات الحيوية PBS التي تحتوي على اثنين من المليمولار EDTA لمدة 30 دقيقة على الجليد دون رج. لتسهيل تصلب المصفوفة خارج الخلية ، أو ECM ، احتضان صفيحة بئر 24 في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية مسبقا.
بعد استنشاق محلول EDTA من شظايا الأنسجة ، أضف 25 مل من المضادات الحيوية الباردة الطازجة PBS. ثم هز الحاوية بقوة باليد ، 30 إلى 40 مرة. قم بتصفية التعليق مرة واحدة من خلال مصفاة 70 ميكرون.
قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، تأكد من وجود الخبايا تحت المجهر. بعد ذلك ، قم بطرد مركزي التعليق عند 390 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم ، أعد تعليق حبيبات القبو في 20 ملليلتر من DMEM تحتوي على 2٪ سوربيتول ، يشار إليها من الآن فصاعدا باسم السوربيتول DMEM.
انقل 10 ملليلتر من تعليق القبو إلى كل من أنبوبين جديدين سعة 15 ملليلتر. هذه المرة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالأنبوبين بسرعة أقل تبلغ 80 جراما لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية لفصل كتل الخلايا الكبيرة عن الخلايا أو الحطام. نضح الطافع برفق ، وترك حوالي ملليلتر من المادة الطافية في كل أنبوب.
ثم أضف 10 ملليلتر من السوربيتول DMEM إلى كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي التعليق مرة أخرى عند 80 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق. نضح المادة الطافية كما هو موضح من قبل ، وإضافة 10 ملليلتر من السوربيتول DMEM لإعادة التعليق.
بعد استنشاق المادة الطافية ، أضف 10 ملليلتر من DMEM الكامل وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. اترك التعليق يرتاح لمدة دقيقة واحدة للحصول على الخبايا العائمة بكفاءة. بعد دقيقة واحدة ، قم بتصفية التعليق من كلا الأنبوبين إلى أنبوب جديد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لتنقية الخبايا.
لحساب الخبايا النقية قبل البذر ، قم بتقطير قطرات 25 ميكرولتر في طبق ستة سنتيمترات في ثلاث نقاط. احسب عدد الخبايا تحت المجهر عند تكبير 4X واحسب تركيز الخبايا لكل 25 ميكرولتر. ثم ، أجهزة الطرد المركزي الترشيح كله عند 290 G لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية.
للبذر ، قم بتعليق الخبايا في ECM بتركيز 100 سرداب لكل 40 ميكرولتر من ECM. ماصة لأعلى ولأسفل خمس إلى 10 مرات تجنب بلطف فقاعات الهواء للحصول على تعليق متجانس. بعد ذلك ، قم بزرع 40 ميكرولترا من تعليق القبو لكل بئر في لوحة البئر 24 التي تم تسخينها مسبقا.
احتضان صفيحة البئر 24 لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لبلمرة ECM. قم بتغطية ECM لكل بئر ب 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على عامل نمو بشرة الفأر والفأر المؤتلف R-Spondin 1 و noggin الفأر المؤتلف. يظهر هنا التركيز النهائي للمواد لكل بئر.
استزرع الخبايا عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإجراء تصوير مباشر لتسجيل التشكل العضوي باستخدام مجهر صور الفاصل الزمني كل ثلاث ساعات لمدة تصل إلى سبعة أيام والحصول على صور مكدسة تسلسلية Z. تم إغلاق جميع الخبايا المعزولة تقريبا على الفور وظهرت على شكل مخروطي بمجرد إخراجها من المنافذ الظهارية.
علاوة على ذلك ، تم دمج الخبايا في الكسر الأخير ومناسبة للاستخدام في الثقافة. كشفت صور الفاصل الزمني للنمو العضوي أن الانتشار النشط والتمايز للخلايا الجذعية المعوية حدث في منطقة القبو مع مهدها. اقترن التبرعم بهجرة الخلايا وانتشارها وتمايز خلايا البانيث.
