بمجرد الحصول على حوالي 25 مليون خلية مانحة للميتوكوندريا في اليوم السابع ، قم بحصاد الخلايا المزروعة أضعافا مضاعفة في أنبوب سعة 50 ملليلتر وجمعها عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة و 520 جراما لمدة خمس دقائق. اغسل الخلايا بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 520 جم لمدة خمس دقائق. الآن فصاعدا ، قم بإجراء استخراج الميتوكوندريا بالكامل عند أربع درجات مئوية باستخدام الكواشف الباردة واحتفظ بالخلايا أو الميتوكوندريا على الجليد.
بعد الطرد المركزي الثالث ، تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام ماصة زجاجية مقترنة بمضخة تفريغ وأعد تعليق الخلايا المعبأة في حجم مخزن مؤقت منخفض التوتر يساوي سبعة أضعاف حجم حبيبات الخلية. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب خالط واترك الخلايا تنتفخ عن طريق احتضانها على الجليد لمدة دقيقتين. كسر أغشية الخلايا عن طريق إجراء 8 إلى 10 ضربات في الخالط إلى جانب مدقة مدفوعة بمحرك تدور بسرعة 600 دورة في الدقيقة.
في تجانس الخلية ، أضف المخزن المؤقت منخفض التوتر يساوي سبعة أضعاف حجم الحبيبات الأولية لتوليد بيئة متساوية التوتر. نقل التجانس إلى أنبوب 15 ملليلتر وجهاز طرد مركزي في دوار ثابت عند 1،000 جرام وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم اجمع 3/4 فقط من المادة الطافية ، تاركا هامشا كبيرا من الحبيبات لتجنب التلوث بالنوى أو الخلايا السليمة ونقلها إلى أنبوب آخر.
بعد تكرار العملية مرتين ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على جزء الميتوكوندريا إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب بسرعة قصوى تبلغ 18،000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات المخصبة بالميتوكوندريا بمحلول أ.اجمع محتوى الأنبوبين في جهاز طرد مركزي واحد كما هو موضح من قبل.
كرر العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط. اغسل الحبيبات التي تم الحصول عليها من آخر طرد مركزي باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.حدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد. قبل الاندماج مع خط الخلية المتلقية للميتوكوندريا ، قم بتقييم عدم وجود ملوثات نوى في جزء الميتوكوندريا عن طريق الكشف المناعي للبروتينات النووية.
بدلا من ذلك ، قم بإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي أو تضخيم QPCR للجين النووي.
