للبدء ، اغسل iPSCs المستنبتة باستخدام برنامج PBS أو DPBS من Dulbecco. وإضافة ملليلتر واحد من خليط تحلل البروتين والكولاجين. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصل الخلايا.
بعد ذلك ، أضف 1.5 ملليلتر من وسيط ثقافة iPSC المسخن مسبقا لإيقاف التفاعل. افصل الخلايا عن طبق زراعة الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من سبع إلى 10 مرات للحصول على تعليق أحادي الخلية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلتر.
بيليه الخلايا في 200xg لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ونضح الطاف. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من وسط الاستزراع iPSC المكمل ب 50 ميكرومولار Y27632.
والآن، استخدم 10 ميكرولترات من معلق الخلية لحساب عدد الخلايا باستخدام حجرة نيوباور. اضبط تركيز معلق الخلية إلى 9،000 خلية لكل 150 ميكرولتر باستخدام وسط ثقافة iPSC المكمل ب 50 ميكرومولار Y27632. لتوليد أجسام جنينية أو EBs ، قم بهز أنبوب تعليق الخلية لمنع ترسيب الخلايا قبل بذر 150 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 96 بئر منخفضة للغاية.
استزرع EBs في جو رطب لمدة 48 ساعة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر. وأضف 150 ميكرولترا من الوسط الطازج المسخن مسبقا بدون Y27632.
قم بإنشاء شبكة غمازة أربعة في أربعة على parafilm عن طريق وضع شبكة parafilm على رف الأنبوب 0.2 ملليلتر مع توجيه الجانب المغلف بالورق لأعلى. واضغط بإصبع قفاز برفق على كل فتحة رف لتضمين EBs في مصفوفة الغشاء القاعدي. ثم قم بإزالة الورق وقطع شبكة الدمل من مربع parafilm باستخدام مقص لضبط حجمه ليتناسب مع طبق زراعة الخلايا 60 ملليلتر.
ضع البارافيلم المدمل مرة أخرى على رف الأنبوب سعة 0.2 ملليلتر لتوفير أساس لتوليد قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي. قم بنقل EBs بعناية واحدة تلو الأخرى من بئر طبق الاستزراع إلى الدمامل parafilm باستخدام ماصة مع طرف ماصة مقطوع 200 ميكرولتر. بعد نقل 16 EBs إلى الشبكة ، خذ طرف ماصة جديد 200 ميكرولتر وقم بإزالة الوسيط المتبقي من الدمامل.
الآن ، ماصة قطرة واحدة من مصفوفة الغشاء القاعدي على كل غمازة تحتوي على EB واحد. خذ طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر وانقل EBs بسرعة إلى وسط كل قطرة دون الإخلال بحدود القطرات. ضع البارافيلم المدمل مع قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي في طبق زراعة الخلايا 60 ملم. واحتضانها لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للمصفوفة بالبلمرة.
علاوة على ذلك ، لفصل EBs المضمنة في المصفوفة عن البارافيلم ، أضف خمسة ملليلتر من وسط التمايز بدون فيتامين أ إلى الطبق. واقلب مربع البارافيلم رأسا على عقب باستخدام ملقط بحيث يكون الجانب مع EBs مواجها لقاع الطبق. هز الطبق بعناية لفصل قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي التي تحتوي على EBs من parafilm.
إذا كان بعضها لا يزال متصلا ، خذ حافة مربع parafilm باستخدام ملقط ولفها بسرعة نحو وسط الطبق عدة مرات. ثم قم بزراعة الكائنات العضوية الدماغية على شاكر مداري عند 55 دورة في الدقيقة في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية. الحفاظ على المواد العضوية في DM دون فيتامين (أ) مع تغييرات متوسطة كل يوم.
يتم عرض صورة برايتفيلد لعضو دماغي بشري لمدة 32 يوما بعد البذر مع هياكل تشبه البطين على المحيط ومورفولوجيا مدمجة وصحية.
