قم بإعداد آلة تجميد الضغط العالي أو HPF ، قبل ساعتين على الأقل من بدء التجربة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. نقل ناقلات الألومنيوم من النوع A HPF إلى أنبوب طرد مركزي 2 ملليمتر يحتوي على واحد من الإيثانول ملليلتر وصوتنة لهم في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. تجفيف الناقلات في طبق بتري مغطاة ورقة ترشيح نوعية.
نقع الناقلات التي تم تنظيفها مسبقا في 1-هيكساديسين. استخدم ملاقط دقيقة لالتقاط قرص ياقوتي معد مسبقا من طبق زراعة خلايا HeLa. المس السطح المسمى بورق ترشيح نوعي لإزالة الوسط الزائد.
قم بتركيب قرص الياقوت في حامل عينة HPF وقم بتغطية القرص بسرعة بحامل ألومنيوم بعمق 0.025 ملم يحتوي على 1-hexadecene. نضح الحل الزائد مع ورق الترشيح النوعي. قم بتحميل حامل العينة للتجميد عالي الضغط.
قم بتفريغ مجموعة حامل قرص الياقوت تحت النيتروجين السائل في صندوق تبريد رغوي. قم بإعداد ملليلتر من تثبيت استبدال التجميد أو محلول FSF واحد في حاوية بولي بروبيلين مستديرة مقاس 20 مم في غطاء دخان وقم بتجميده باستخدام النيتروجين السائل. استخدم زوجا من الملقط المبرد مسبقا لتحميل أقراص الياقوت وتجميعات الناقل في الحاوية بمحلول FSF المجمد تحت النيتروجين السائل.
انقل هذه الحاوية إلى غرفة آلة استبدال التجميد الأوتوماتيكية المبردة مسبقا لمعالجة FSF عند 90 درجة مئوية تحت الصفر. احتفظ بالعينات عند 90 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة ، ثم افصل أقراص الياقوت عن الناقلات باستخدام ملاقط مبردة مسبقا ، مع التأكد من أن الجوانب المحددة لأقراص الياقوت متجهة لأسفل. احتفظ بالعينات عند 90 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 8 إلى 10 ساعات إضافية قبل الاحماء إلى 60 درجة مئوية تحت الصفر في غضون ثلاث ساعات.
استبدل محلول FSF في الحاوية بالأسيتون المبرد مسبقا واحتضانه عند 60 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة. كرر غسل الأسيتون مرتين. الاحماء إلى ناقص 30 درجة مئوية في غضون ثلاث ساعات.
وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد وتبريد ملليلتر من محلول FSF الثاني في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مليلتر عند 30 درجة مئوية تحت الصفر. استبدل الأسيتون بمحلول FSF الثاني واحتضانه عند 30 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ثلاث ساعات. ثم استبدل محلول FSF الثاني في الحاوية بالأسيتون المبرد مسبقا واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية تحت الصفر.
كرر غسل الأسيتون مرتين. يسخن لمدة 30 إلى 4 درجات مئوية تحت الصفر في غضون ساعتين. استبدل الأسيتون بملليلتر من 0.2 مولار HEPES buffer.
قم بتغيير المخزن المؤقت مرة واحدة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية طوال الليل.
