قم بتشغيل المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر وضع الشريحة على حامل الشريحة. لتصور الصورة واكتسابها ، حدد العدسة الموضوعية 20X. من برنامج متحد البؤر ، حدد وضع المسح المتسلسل لتجنب التشويش المتبادل بين BODIPY 493/503 و DAPI.
ثم قم بإثارة قالب BODIPY 493/503 باستخدام خط ليزر الأرجون 488 نانومتر وصبغة DAPI باستخدام خط الليزر 405 نانومتر. اضبط نطاقات الانبعاثات من 493 إلى 589 نانومتر ل BODIPY و 410 إلى 464 نانومتر ل DAPI. بعد ذلك ، قم بتكوين إعدادات المجهر عن طريق ضبط أحجام الإطارات وسرعة المسح والمتوسط الذي يتضمن عمق البت مرتين مثل 12 بت ، والاتجاه ثنائي الاتجاه ، والتكبير الرقمي لمنطقة المسح ناقص واحد ، والثقب ناقص وحدة مساحة واحدة.
اضبط إعدادات الكسب والكسب الرقمي. تأكد من عدم وجود وحدات بكسل مشبعة كما هو موضح في مؤشر النطاق. بعد تحديد قطرات الدهون بدقة ، احصل على الصورة باستخدام قنوات BODIPY و DAPI.
لإنشاء صور واسعة النطاق، قم بالتبديل إلى عدسة ذاتية 10X. ثم قم بتنشيط وضع مسح البلاط وتكوينه لإنشاء خمس صور فسيفساء في خمسة. لتوليد طرق عرض 3D ومتعامدة ، ضع قطرة من زيت الغمر على الجزء العلوي من زجاج الغطاء وقم بتغيير العدسة الموضوعية إلى عدسة 40X.
حدد وضع Z-stack. اضبط المستوى Z لتحديد الموضعين الأول والأخير لالتقاط الصور ، مما يضمن سمك شريحة بصرية يبلغ حوالي 0.5 ميكرون لالتقاط جميع القطرات في التركيز البؤري. حدد وحدة ortho وقم بإنشاء طرق عرض متعامدة.
احصل على صور ثلاثية الأبعاد عن طريق تحديد الوحدة ثلاثية الأبعاد بعد وضع عرض الشفافية. بعد الحصول على الصور، ابدأ في معالجة الصور أحادية المستوى وتحليلها باستخدام CellProfiler. قم بتحميل الصور بتنسيق TIF بالنقر فوق وضع الصور في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة CellProfiler.
استخدم وحدة الأسماء والأنواع للفرز بين قطرات BODIPY والصور الملطخة بنوى DAPI بناء على أسماء الملفات. لتحليل قطرات الدهون ، استخدم فقط الصور الملطخة BODIPY. ابدأ بناء خط الأنابيب بالنقر فوق ضبط الوحدات وتحديد وحدة اللون إلى الرمادي لتحويل الصور إلى مقياس رمادي.
ثم باستخدام وحدة تحديد الكائنات الأولية ، حدد قطرات الدهون بين 6 إلى 300 بكسل وعامل تصحيح عتبة واحد لاكتشاف قطرات الدهون داخل صور التدرج الرمادي. لقياس شدة البكسل لقطرات الدهون المحددة ، أضف وحدة قياس شدة الكائن. قم بدمج وحدة كائنات مرشح إضافية لضمان تحديد الإشارات الأقوى فقط بينما يتم استبعاد الإشارات الأقل كثافة من التحليل النهائي لقطرات الدهون.
بعد ذلك ، لقياس قطرات الدهون المتعلقة ببيانات الإخراج ، أضف وحدة شكل قياس حجم الكائن. ثم أضف وحدة مخططات تراكب لتراكب القطرة المحددة على الصورة الأصلية وبالتالي التأكد من أن التجزئة تبدو دقيقة على الصورة غير المعالجة أيضا. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف تصديرا إلى وحدة جدول البيانات وانقر على زر تحليل الصور من الزاوية اليسرى السفلية.
بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، قدمت الحيوانات التي تغذت على HFD صورة واضحة لعسر شحميات الدم وزيادة طفيفة في مستويات الدهون الثلاثية المتداولة. كشفت صور منطقة واسعة عن زيادة قطرات الدهون عبر أكباد الحيوانات التي تتغذى على HFD. كشف التحليل باستخدام CellProfiler عن زيادة عدد قطرات الدهون الكبدية ، وزيادة شدة مضان BODIPY ، ونسبة مساحة 360٪ ، وأقطار أكبر.
كشف توزيع الحجم في الحيوانات التي تتغذى على HFD عن زيادة في قطرات الدهون الكبدية الحويصلية الكبيرة لأكثر من تسعة ميكرونات وانخفاض في الحويصلات الدقيقة أقل من ثلاثة ميكرونات.
