تم تمويل هذا البحث من قبل الصناديق الوطنية والأوروبية عبر مؤسسة العلوم والتكنولوجيا البرتغالية (FCT) ، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ، وبرنامج العوامل التشغيلية للمنافسة (COMPETE): 2020.09481.BD ، UIDP / 04539/2020 (CIBB) ، و POCI-01-0145-FEDER-007440. يود المؤلفون أن يشكروا دعم iLAB - مختبر الفحص المجهري والتصوير الحيوي ، وهو مرفق تابع لكلية الطب بجامعة كويمبرا وعضو في البنية التحتية الوطنية PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122) ، بالإضافة إلى الدعم من FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل هيئة رعاية الحيوان التابعة لمعهد كويمبرا للبحوث السريرية والطبية الحيوية (iCBR) (ORBEA ، # 9/2018) وامتثلت للتوجيهات الوطنية والأوروبية لرعاية الحيوان ومع إرشادات ARRIVE.
1. التصميم التجريبي
<ol><li>ذكور فئران Wistar البالغة من العمر 13 أسبوعا في أقفاص جيدة التهوية في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة لدرجة الحرارة (22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) والرطوبة (50٪ -60٪) والضوء (12 ساعة دورة الضوء والظلام ) ومع الوصول إلى مياه الصنبور وتشاو القوارض القياسية.</li>
	<li>بعد فترة 2 أسبوع من التأقلم ، تعيين الفئران بشكل تعسفي إلى مجموعتين.</li>
	<li>قم بتغذية المجموعة الضابطة (CTRL ، n = 6) ومجموعات النظام الغذائي عالية الدهون (HFD ، n = 6) مع تشاو قياسي ونظام غذائي عالي الدهون (45٪ كيلو كالوري / دهون) ، على التوالي ، لمدة 24 أسبوعا.</li>
	<li>مراقبة وزن الجسم (BW) أسبوعيا. سجل استهلاك الأطعمة والمشروبات يوميا لكل قفص.</li>
</ol>2. تحضير عينة الكبد
<ol><li>تشريح الكبد<ol><li>تحضير المضخة التمعجية: قم بتشغيل 70٪ من الإيثانول عبر الأنبوب ، وقم بتوصيل إبرة 27 جم بنهاية مخرج الأنبوب ، وقم بتجهيز الأنبوب بمحلول ملحي بارد (4 درجات مئوية) 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة ~ 7.4) (على سبيل المثال ، 200 دورة في الدقيقة على مضخة تمعجية مع أنبوب سيليكون 1.6 مم معرف ، مجموعة تنقيط صغيرة IV). اضبط وزن الجسم (على سبيل المثال ، بالنسبة للفأر 100-150 جم ، استخدم معدل تدفق يبلغ حوالي 10-12 مل / دقيقة).</li>
		<li>تخدير الجرذ عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام بروتوكول التخدير (التركيز النهائي للكيتامين = 75 ملغم / كغم ، والتركيز النهائي للميديتوميدين = 1 ملغم / كغم). ملاحظة: تأكد من تخدير الجرذ تماما باستخدام طريقة استجابة قرصة إصبع القدم.</li>
		<li>ضع الجرذ على صينية التشريح.</li>
		<li>قم بتطهير الفراء جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وجففه بمنشفة ورقية.</li>
		<li>باستخدام المقص ، قم بعمل شق على شكل حرف "U" عبر الجلد ، واقطعه أسفل الحجاب الحاجز. ثم ، قم بقص القفص الصدري بشكل دائري على الحواف لفضح القلب.</li>
		<li>أثناء تشغيل 1x PBS ، مرر الإبرة عبر البطين الأيسر إلى الشريان الأورطي الصاعد ، والمشبك. بعد ذلك ، يتم قطع الأذين الأيمن للسماح بالتصريف بمجرد بدء التروية. ملاحظة: يجب أن يبدأ الكبد في التبييض حيث يتم استبدال الدم ب PBS.</li>
		<li>باستخدام المقص وملقط Dumont ، قم بإزالة الكبد بعناية ، واشطفه باستخدام 1x PBS.</li>
		<li>نقل الكبد إلى طبق بتري ، ووزنه.</li>
		<li>باستخدام مشرط ، اجمع عينات الأنسجة الكبدية بسمك 5 مم من الجانب الجانبي (1 سم من الحافة) من الفص الأيسر للكبد لعملية التضمين. ملاحظة يمكن تخزين الأنسجة المتبقية في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.</li>
	</ol></li>
	<li>تضمين أنسجة الكبد<ol><li>قم بإعداد وعاء ثلج جاف ، وقم بتسمية قوالب التبريد بشكل صحيح بمعرف العينة والاتجاه.</li>
		<li>ضع بضع قطرات من مصفوفة التضمين بالتبريد على وسط cryomold لعمل درجة حرارة القطع المثلى (OCT).</li>
		<li>تأكد من توجيه عينة الأنسجة بشكل صحيح لقسم عرضي. ملاحظة: تأكد من أن الجانب الذي يلامس الجزء السفلي من cryomold هو الجانب الذي سيتم تقسيمه أولا.</li>
		<li>قم بإسقاط المزيد من OCT بعناية على cryomold حتى يتم تغطيته بالكامل. حاول تجنب تكوين فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، باستخدام ملقط عادي ، قم بإزالة أي فقاعات داخل OCT.</li>
		<li>ضع cryomold بسرعة مع العينة المغطاة OCT في وعاء ثلج جاف. ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة في -80 درجة مئوية لمدة 3 سنوات.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تقسيم الأنسجة المجمدة
<ol><li>اضبط درجة حرارة cryostat (الغرفة: -21 درجة مئوية ؛ العينة: -18 درجة مئوية) ، وأدخل شفرة معقمة جديدة.</li>
	<li>ضع العينات في جهاز التبريد لمدة 30 دقيقة قبل السماح لتوازن درجة الحرارة.</li>
	<li>اصنع طبقة واحدة من OCT على قرص العينة للسماح بالتصاق العينة. اسمح ل OCT بالتجميد ، وقم بتركيب عينة الأنسجة في الاتجاه المطلوب. ملاحظة: يجب أن يكون سطح القطع موازيا للشفرة. للحفاظ على التصاق جيد ، ضع مستخرج الحرارة أعلى العينة. يمكن أيضا تنفيذ الخطوات السابقة في وعاء ثلج جاف به ثلج جاف.</li>
	<li>ضع العينة في رأس العينة ، وقم بقص سطح الأنسجة (بضعة أقسام عينة من الأنسجة 30 ميكرومتر).</li>
	<li>بمجرد الوصول إلى منطقة الاهتمام للتقسيم ، قم بقطع أقسام بسمك 12 ميكرومتر ، وضعها على شرائح مجهرية مصنفة محفوظة في درجة حرارة الغرفة (RT). ملاحظة: لجمع القسم، حرك الشريحة ببطء نحو قسم الأنسجة. يمكن لكل شريحة جمع قسمين من الكبد.</li>
	<li>اترك الشرائح تجف لمدة 10 دقائق في RT. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرا أو عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 سنوات.</li>
</ol>4. تلطيخ بوديبي
<ol><li>قم بإذابة الشرائح في نظام تلطيخ الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>يغسل مع 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).</li>
	<li>ضع دائرة حول القسم بطبقة كارهة للماء باستخدام قلم حاجز.</li>
	<li>تحضير محلول مخزون BODIPY 493/503 500 ميكروغرام / مل: قم بإذابة 1 مجم من BODIPY 493/503in 2 مل من المذيب (90٪ DMSO ؛ 10٪ 1x PBS). يحفظ بعيدا عن الضوء. Sonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 ساعة (9.5-10 W) عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل.</li>
	<li>قم بإعداد محلول تلطيخ BODIPY (1 ميكروغرام / مل) بإضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون BODIPY 493/503 و 0.1 ميكرولتر من محلول مخزون DAPI (5 مجم / مل) إلى 997.9 ميكرولتر من 1x PBS.</li>
	<li>احتضان الشرائح (75 ميكرولتر / شريحة) باستخدام BODIPY 493/503 (1 ميكروغرام / مل) و DAPI (0.1 ميكروغرام / مل) في RT لمدة 40 دقيقة. ملاحظة: احتفظ بالشرائح في الظلام من هذه الخطوة فصاعدا.</li>
	<li>اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).</li>
	<li>قم بتركيب الشرائح باستخدام أغطية باستخدام وسيط تثبيت مضان ، واتركها تجف لمدة 30 دقيقة ، وأغلقها بطلاء الأظافر. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.</li>
</ol>5. تحديد كمية الدهون
<ol><li>قم بقياس مستويات الكوليسترول الكلي في الدم و TG باستخدام طريقة ومعدات تلقائية تم التحقق من صحتها.</li>
	<li>قم بقياس مستويات TG الكبدية باستخدام مجموعة الفحص اللوني للدهون الثلاثية (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.</li>
</ol>6. الحصول على الصور
<ol><li>ضع الشريحة على حامل شرائح المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر.</li>
	<li>لتصور الصورة والحصول عليها ، استخدم مجهرا متحد البؤر بعدسة موضوعية 20x (plan-apochromat: 20x / 0.8).</li>
	<li>لتجنب الحديث المتبادل بين BODIPY 493/503 و DAPI ، استخدم وضع المسح المتسلسل (أفضل إشارة) على البرنامج البؤري.</li>
	<li>قم بإثارة BODIPY 593/503 باستخدام خط ليزر الأرجون 488 نانومتر و DAPI باستخدام خط الليزر 405 نانومتر. اضبط نطاقات الانبعاثات عند 493-589 نانومتر ل BODIPY 493/503 وعند 410-464 نانومتر ل DAPI.</li>
	<li>استخدم الإعدادات التالية: الثقب: 1 وحدة فلكية، الدقة: 1024 بكسل × 1024 بكسل، عمق البت: 12، حجم البكسل: 0.415 ميكرومتر، الوضع ثنائي الاتجاه، سرعة المسح الضوئي: 7 (~ 1.58 ميكرو ثانية/بكسل لهدف 20x)، متوسط الخط: 2x، والتكبير الرقمي: 1. ملاحظة: يجب تحسين معلمات المسح المذكورة أعلاه لكل مجهر متحد البؤر والهدف المستخدم.</li>
	<li>اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب بحيث لا يتم اكتشاف أي وحدات بكسل مشبعة على مؤشر النطاق. ملاحظة: قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة.</li>
	<li>بمجرد تحديد LDs بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات BODIPY و DAPI. ملاحظة: يجب التقاط جميع الصور في نفس الظروف (التعرض والإعدادات العامة) لكل قناة لون.</li>
	<li>لإنشاء صور واسعة المساحة (الشكل 2) ، قم بتغيير الهدف إلى عدسة موضوعية a10x (مخطط نيوفلور: 10x / 0.3).</li>
	<li>حدد وضع مسح التجانب ، وقم بعمل فسيفساء من 5 لكل 5 صور. ملاحظة: في هذا العمل ، كان لكل بلاطة تداخل بنسبة 10٪ من أجل دمج المربعات بشكل مناسب للتحليل.</li>
	<li>لإنشاء طرق عرض ثلاثية الأبعاد ومتعامدة (الشكل 3 أ) ، ضع قطرة من زيت الغمر أعلى زجاج الغطاء ، وقم بتغيير الهدف إلى عدسة موضوعية 40x (مخطط نيوفلور: زيت 40x / 1.30).</li>
	<li>حدد وضع Z-Stack ، وبضبط مستوى Z ، حدد المواضع الأولى والأخيرة للاكتساب باستخدام شريحة بصرية بسمك مثالي (~ 0.5 ميكرومتر) لضمان التقاط جميع القطرات. ملاحظة: لتسريع الحصول على الصورة وتجنب التبييض ، يمكن ضبط الشريحة الضوئية على حجم دون المستوى الأمثل ، مما يضمن أخذ عينات زائدة بنسبة 30٪ على الأقل لإعادة بناء ثلاثية الأبعاد جيدة.</li>
	<li>حدد وحدة Ortho ، وقم بإنشاء طرق عرض متعامدة.</li>
	<li>احصل على صور ثلاثية الأبعاد عن طريق تحديد الوحدة ثلاثية الأبعاد بعد وضع تقديم الشفافية باستخدام برنامج المجهر متحد البؤر.</li>
</ol>7. تحليل الصور
<ol><li>معالجة وتحليل الصور أحادية المستوى (تكبير 20x) باستخدام CellProfiler (الإصدار 4.2.5). ملاحظة: تم تكييف خط الأنابيب المستخدم في هذا العمل من Adomshick et al.45.</li>
	<li>انقر فوق وحدة الصور في الزاوية العلوية اليسرى من نافذة CellProfiler ، وقم بتحميل الصور كملفات .tiff.</li>
	<li>استخدم الوحدة النمطية NamesAndTypes للفرز بين الصور الملطخة BODIPY- (قطرة) و DAPI- (النوى) بناء على أسماء الملفات. قم بإجراء تحليل LD فقط مع الصور الملطخة ب BODIPY.</li>
	<li>لبدء إنشاء خط الأنابيب ، انقر فوق ضبط الوحدات النمطية ، وحدد الوحدة النمطية ColorToGray لتحويل الصور إلى صور ذات تدرج رمادي. ملاحظة: لتحديد الكائنات، يلزم وجود صور بتدرج الرمادي.</li>
	<li>حدد القطرات باستخدام وحدة IdentifyPrimaryObjects باستخدام صورة التدرج الرمادي. ملاحظة: يجب ضبط المعلمات في هذه الوحدة لتحقيق تحديد جيد ل LD. في هذا العمل ، أدى تحديد LDs بحجم يتراوح بين 6 بكسل و 300 بكسل وعامل تصحيح عتبة 1.0 إلى تحديد الهوية الأكثر دقة.</li>
	<li>لقياس كثافة البكسل لقطرات الدهون المحددة ، أضف وحدة MeasureObjectIntensity .</li>
	<li>أضف وحدة FilterObjects إضافية لضمان تحديد الإشارات الأقوى فقط بينما يتم استبعاد الإشارات الأقل كثافة من تحليل قطرات الدهون النهائي (الحد الأدنى للشدة: 0.15 ؛ الحد الأقصى للشدة: 1 وحدة تعسفية).</li>
	<li>لقياس LDs المتعلقة ببيانات الإخراج ، أضف الوحدة النمطية MeasureObjectSizeShape .</li>
	<li>أضف وحدة OverlayOutlines في هذه المرحلة لتراكب المعالجة التجميعية المحددة على الصورة الأصلية ، وبالتالي ، تأكد من أن التجزئة تبدو دقيقة على الصورة غير المعالجة أيضا. ملاحظة: هذه خطوة اختيارية (مراقبة الجودة).</li>
	<li>أضف وحدة ExportToSpreadsheet في النهاية ، وانقر فوق الزر "تحليل الصور " في الزاوية اليسرى السفلية.</li>
</ol>8. التحليل الإحصائي
<ol><li>عبر عن النتائج كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (S.E.M.) باستخدام أي تطبيق برنامج تحليل إحصائي. ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام برنامج GraphPad للتحليل الإحصائي.</li>
	<li>تحليل توزيع القيم باستخدام اختبار Kolmogorov-Smirnov لتقييم الانحرافات الكبيرة عن الحالة الطبيعية. تحليل البيانات البارامترية باستخدام اختبار t غير المزاوج للطالب. ملاحظة: اعتبرت قيم p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.</li>
</ol>

تقييم تنكس دهني كبدي مع 3D مضان إعادة بناء قطرات الدهون

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يهدف هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 لتقييم LD إلى تطوير نهج تصوير جديد لتقييم التنكس الدهني الكبدي. نظرا للعلاقة القوية بين السمنة وأمراض الكبد الدهنية ، تم استخدام النظام الغذائي عالي الدهون على النمط الغربي لإنشاء نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي26. تم تأكيد زيادة ?...

قطرات الدهون (LDs) ، التي ينظر إليها تقليديا على أنها مستودعات للطاقة ، هي عضيات خلوية متخصصة تتوسط في تخزين الدهون ، وهي تتألف من نواة دهنية محايدة كارهة للماء ، والتي تحتوي بشكل أساسي على استرات الكوليسترول والدهون الثلاثية (TGs) ، مغلفة بطبقة أحادية فوسفوليبيد1،2،3.
يحدث التكوين الحيوي LD في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، بدءا من تخليق ثلاثي الجلسرين (TAG) واسترات الستيرول. تنتشر الدهون المحايدة بين وريقات الطبقة المزدوجة ER بتركيزات منخفضة ولكنها تتجمع في عدسات زيتية تنمو وتنبت في قطرات كروية تقريبا من غشاء ER عندما يزيد تركيزها داخل الخلايا4. بعد ذلك ، تنتقل البروتينات من طبقة ER المزدوجة والعصارة الخلوية ، وخاصة عائلة بروتين perilipin (PLIN) ، إلى أسطح LDs لتسهيل التبرعم5،6،7،8،9.
من خلال تخليق الأحماض الدهنية الجديدة واندماج LD أو الاندماج ، تنمو LDs إلى أحجام مختلفة. وفقا لذلك ، يختلف حجم وعدد LDs اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة. يمكن تشكيل قطرات صغيرة (قطرها 300-800 نانومتر) ، والتي تعرف باسم LDs الأولية (iLDs) ، بواسطة جميع الخلايا4 تقريبا. في وقت لاحق من تكوين LD ، تكون معظم الخلايا قادرة على تحويل بعض iLDs إلى LDs أكبر حجما (قطرها > 1 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن أنواعا معينة فقط من الخلايا ، مثل الخلايا الشحمية وخلايا الكبد ، لديها القدرة على تكوين LDs عملاقة أو كبيرة الحجم (يصل قطرها إلى عشرات الميكرونات)4,10.
تلعب LDs دورا مهما جدا في تنظيم استقلاب الدهون الخلوية ، وقمع السمية الدهنية ، ومنع إجهاد ER ، واختلال وظائف الميتوكوندريا ، وفي النهاية موت الخلايا الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs) 11،12،13،14. علاوة على ذلك ، تورطت LDs أيضا في تنظيم التعبير الجيني ، وعزل بروتين التكاثر الفيروسي ، والاتجار بالأغشية والإشارة15،16،17. لذلك ، فإن سوء تنظيم التكوين الحيوي LD هو السمة المميزة للأمراض المزمنة المرتبطة بمتلازمة التمثيل الغذائي ، والسمنة ، وداء السكري من النوع 2 (T2DM) ، و / أو تصلب الشرايين ، على سبيل المثال لا الحصر18،19،20.
الكبد ، كمركز استقلابي ، مسؤول في الغالب عن استقلاب الدهون عن طريق تخزين ومعالجة الدهون ، وبالتالي ، فهو مهدد باستمرار بالسمية الدهنية21. التنكس الدهني الكبدي (HS) هو سمة شائعة لسلسلة من أمراض الكبد التقدمية ويتميز بتراكم الدهون المفرط داخل الخلايا في شكل LDs الخلوية التي قد تؤدي في النهاية إلى خلل وظيفي في التمثيل الغذائي في الكبد ، والتهاب ، وأشكال متقدمة من مرض الكبد الدهني غير الكحولي22،23،24،25. يحدث HS عندما يكون معدل أكسدة الأحماض الدهنية وتصديرها كدهون ثلاثية داخل البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDLs) أقل من معدل امتصاص الأحماض الدهنية الكبدية من البلازما وتخليق الأحماض الدهنية الجديدة 26. غالبا ما يحدث التراكم الكبدي للدهون في شكلين - التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير - وهذه تظهر خصائص معمارية خلوية مميزة27. عادة ، يتميز التنكس الدهني الحويصلي الدقيق بوجود LDs صغيرة منتشرة في جميع أنحاء خلية الكبد مع وضع النواة مركزيا ، في حين يتميز التنكس الدهني الحويصلي الكبير بوجود LD كبير واحد يحتل الجزء الأكبر من خلية الكبد ، مما يدفع النواة إلى المحيط28,29. والجدير بالذكر أن هذين النوعين من التنكس الدهني غالبا ما يتم العثور عليهما معا ، ولا يزال من غير الواضح كيف يؤثر هذان النمطان من LD على التسبب في المرض ، حيث لا تزال الأدلة غير متسقة31،32،33،34. ومع ذلك ، غالبا ما يستخدم هذا النوع من التحليل ك "معيار مرجعي" في الدراسات قبل السريرية والسريرية لفهم السلوك الديناميكي ل LDs وتوصيف التنكس الدهني الكبدي29،34،35،36.
يتم تقييم خزعات الكبد ، المعيار الذهبي لتشخيص وتصنيف HS ، بشكل روتيني عن طريق تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) النسيجي ، حيث يتم تقييم قطرات الدهون على أنها فجوات غير ملوثة في أقسام الكبد الملطخة H&E37. في حين أنه مقبول لتقييم التنكس الدهني الحويصلي الكبير ، فإن هذا النوع من التلوين يضيق عموما تقييم التنكس الدهني الحويصليالدقيق 38. يتم دمج أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل Oil Red O (ORO) ، بشكل كلاسيكي مع الفحص المجهري برايتفيلد لتحليل مخازن الدهون داخل الخلايا ، ولكن لا يزال لها عدد من العيوب: (i) استخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول في عملية التلوين ، والتي غالبا ما تسبب تعطيل LDs الأصلية والانصهار العرضي على الرغم من إصلاح الخلايا39; (ii) الطبيعة المستهلكة للوقت ، حيث يتطلب محلول ORO إذابة مسحوق طازج وترشيحه بسبب مدة الصلاحية المحدودة ، مما يساهم في نتائج أقل اتساقا ؛ (iii) وحقيقة أن ORO يلطخ أكثر من مجرد قطرات دهنية وغالبا ما يبالغ في تقدير التنكس الدهني الكبدي38.
وبالتالي ، تم استخدام الفلوروفورات المحبة للدهون المنفذة للخلايا ، مثل النيل الأحمر ، إما في عينات حية أو ثابتة للتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لوضع العلامات على عضيات الدهون الخلوية تضيق مرارا وتكرارا تقييمات LD40. علاوة على ذلك ، تختلف الخصائص الطيفية لأحمر النيل وفقا لقطبية البيئة ، والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى تحولات طيفية41.
مسبار الفلورسنت المحب للدهون 1،3،5،7،8-خماسي ميثيل-4-بورا-3a، 4adiaza-s-indacene (الطول الموجي للإثارة: 480 نانومتر ؛ الحد الأقصى للانبعاث: 515 نانومتر ؛ BODIPY 493/503) خصائص الكارهة للماء التي تسمح بامتصاصه السريع بواسطة LDs داخل الخلايا ، ويتراكم في قلب قطرات الدهون ، وبالتالي ينبعث منه مضان أخضر فاتح12. على عكس النيل الأحمر ، فإن BODIPY 493/503 غير حساس لقطبية البيئة وقد ثبت أنه أكثر انتقائية ، لأنه يعرض سطوعا عاليا لتصوير LD. من أجل تلطيخ LDs المحايدة ، يمكن استخدام هذه الصبغة في الخلايا الحية أو الثابتة وتقترن بنجاح بطرق تلطيخ و / أو وضع العلامات الأخرى42. ميزة أخرى للصبغة هي أنها تتطلب القليل من الجهد لوضعها في محلول ومستقرة ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى إعدادها حديثا لكل تجربة42. على الرغم من أن مسبار BODIPY 493/503 قد تم استخدامه بنجاح لتصور توطين وديناميكيات LDs في مزارع الخلايا ، فقد أظهرت بعض التقارير أيضا الاستخدام الموثوق لهذه الصبغة كأداة تصوير LD في الأنسجة بما في ذلك عضلة الأوعية الدموية البشرية43 ، وعضلة الفئران الوحيدة 42 ، وأمعاء الفأر44.
هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على BODIPY 493/503 كنهج تحليلي بديل لتقييم رقم LD ومساحته وقطره في عينات الكبد من نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي. يغطي هذا الإجراء تحضير عينة الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وظروف التلوين ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

قطرات الدهون (LDs) هي عضيات متخصصة تتوسط في تخزين الدهون وتلعب دورا مهما للغاية في قمع السمية الدهنية ومنع الخلل الوظيفي الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs). الكبد ، نظرا لدوره الحاسم في استقلاب الدهون في الجسم ، مهدد باستمرار من خلال تراكم LDs داخل الخلايا في شكل تنكس دهني كبدي حويصلي وكبير. يعتمد التوصيف النسيجي ل LDs عادة على أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل تلطيخ Oil Red O (ORO) ، ولكن هناك عددا من العيوب التي تعيق باستمرار استخدام هذا التحليل مع عينات الكبد. في الآونة الأخيرة ، أصبحت الفلوروفورات المحبة للدهون 493/503 شائعة لتصور وتحديد موقع LDs بسبب امتصاصها السريع وتراكمها في قلب قطرات الدهون المحايدة. على الرغم من أن معظم التطبيقات موصوفة جيدا في مزارع الخلايا ، إلا أن هناك أدلة أقل تثبت الاستخدام الموثوق لتحقيقات الفلوروفور المحبة للدهون كأداة تصوير LD في عينات الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على ثنائي بيروميثين البورون (BODIPY) 493/503 لتقييم LDs في عينات الكبد من نموذج حيواني لنظام غذائي عالي الدهون (HFD) الناجم عن تنكس دهني كبدي. يغطي هذا البروتوكول تحضير عينات الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وتلطيخ BODIPY 493/503 ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات. لقد أظهرنا زيادة في عدد وشدة ونسبة المساحة وقطر LDs الكبدية عند تغذية HFD. باستخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، كان من الممكن مراقبة المحتوى الكامل للدهون المحايدة في قلب LD ، والتي ظهرت على شكل قطرات كروية تقريبا. علاوة على ذلك ، مع الفلوروفور BODIPY 493/503 ، تمكنا من التمييز بين الحويصلات الدقيقة (1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر) ، والحويصلات الوسيطة (3 ميكرومتر < د ≤ 9 ميكرومتر) ، والحويصلات الكبيرة (د > 9 ميكرومتر) ، مما يسمح بالتمييز الناجح للتنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير . بشكل عام ، يعد هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 أداة موثوقة وبسيطة لتوصيف LD الكبدي وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

تسليط الضوء على المؤلف: تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي  

تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

يجب أن يؤدي التنفيذ الناجح لهذه التقنية إلى تلطيخ واضح لقطرات الدهون للتوصيف المتزامن لمورفولوجيا LD (الشكل وكثافة لب الدهون بناء على إعادة البناء ثلاثية الأبعاد) جنبا إلى جنب مع توزيعها المكاني ، والعدد لكل مساحة إجمالية ، ومتوسط الحجم (تم تقييمه باستخدام خط الأنابيب الموصوف أعلاه ، <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment at JoVE.com

هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا قائما على مضان BODIPY 493/503 لتوصيف قطرات الدهون في أنسجة الكبد. من خلال استخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، يسمح الفلوروفور بالتمييز الناجح بين التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية لتقييم التنكس الدهني الكبدي.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

يسمح نهج التصوير هذا بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لترسب قطرات الدهون الكبدية ويتغلب على العيوب الرئيسية للتلطيخ النسيجي الكلاسيكي الذي ضيق التمييز الناجح بين التنكس الدهني الجزئي والكبير. يتم تقييم التنكس الدهني الحويصلي الدقيق عندما يتم استخدام البقع النسيجية القياسية الذهبية ، سواء أو Oil Red ، بسبب الاضطراب والانصهار العرضي لقطرات الدهون الأصلية. يقدم pro-BODIPY بديلا للبروتوكولات الروتينية لتقييم التنكس الدهني الكبدي الحويصلي الدقيق بسبب كرهه للماء الأيمن من أجل امتصاص سريع ووضع علامات فعالة على قطرات الدهون ، ليس فقط غير حساس لقطبية البيئة ، ولكن أيضا انتقائي للغاية.يتضمن نهج التصوير هذا تطبيقات أوسع بالاقتران مع تقنيات الكيمياء المناعية ، مما يسمح بالكشف المتزامن عن المستضدات تحت الخلوية الأخرى التي قد تعزز دراسة التكوين الحيوي لقطرات الدهون وديناميكياتها ، مما يدعم التنكس الدهني الكبدي الجزئي والكبير الحويصلي.

analysis-fluorescent-stained-lipid-droplets-with-3d-reconstruction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K Views.  University of Coimbra. يسمح نهج التصوير هذا بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لترسب قطرات الدهون الكبدية ويتغلب على العيوب الرئيسية للتلطيخ النسيجي الكلاسيكي الذي ضيق التمييز الناجح بين التنكس الدهني الجزئي والكبير. يتم تقييم التنكس الدهني الحويصلي الدقيق عندما يتم استخدام البقع النسيجية القياسية ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

تقسيم أنسجة الكبد المجمدة وتلطيخ قطرات الدهون BODIPY

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.