في اليوم الأول بعد ربط الكروماتين وجمع النوى من 5000 شاب بالغ من ديدان Caenorhabditis Elegans ، قم بنقل حبيبات النوى المعاد تعليقها في 450 ميكرولتر من الماء النظيف إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 60 ميكرولترا من محلول إنزيم تقييد 10X DPN2 إليه واخلطه جيدا. احتضان العينات مع 15 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم 10 ٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع تحريك.
إخماد التفاعل بإضافة 75 ميكرولتر من 20٪ تريتون × 100 واحتضانها كما هو موضح سابقا. قسمة 10 ميكرولتر من العينة ، كما السيطرة غير المهضومة ، وتخزينها في أربع درجات مئوية. بعد إضافة 400 وحدة من DPN 2 إلى بقية العينة ، احتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التقليب لهضم الكروماتين.
في اليوم الثاني ، أضف 200 وحدة إضافية من DPN 2 إلى العينة. لإكمال هضم العينة المتشابكة ، احتضانها عند 37 درجة مئوية مع التحريك لمدة أربع ساعات. الحرارة تعطل إنزيم القطع عن طريق احتضان العينة لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة سلزية.
إذا تعذر تعطيل الإنزيم بالحرارة ، أضف 80 ميكرولترا من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم واحتضانها. ثم أضف 375 ميكرولترا من 20٪ Triton X 100 إلى العينة واخلطها بالدوامة. احتفظ جانبا بقسمة 10 ميكرولتر من العينة كعنصر تحكم في الهضم.
لربط الكروماتين ، انقل العينة إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلتر. اضبط حجم العينة على 5.7 ملليلتر بماء من الدرجة الجزيئية واخلطه عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، أضف 700 ميكرولتر من 10 X T4 ligase buffer ، متبوعا ب 60 وحدة من T4 DNA ligase ، واحتضان العينة طوال الليل عند 16 درجة مئوية.
في اليوم الثالث ، تابع هضم البروتين والربط العكسي المتقاطع. أضف 30 ميكرولترا من 10 ملليغرام لكل ملليلتر من Proteinase K إلى عينة 3C واحتضانها عند 65 درجة مئوية طوال الليل مع التقليب. لبدء تنقية مكتبة 3C في اليوم الرابع ، أضف 30 ميكرولترا من 10 ملليغرام لكل ملليلتر RNase A إلى العينة واخلطها عن طريق الدوامة.
بعد الحضانة ، أضف سبعة ملليلتر من فينيل كلوروفورم إلى العينات واخلطها بالهز. أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة عند 3،270 جم ودرجة حرارة الغرفة. جمع ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 ملليلتر.
أضف كميات متساوية من الكلوروفورم واخلط العينة عن طريق الهز. بعد طرد العينة مرة أخرى كما هو موضح ، انقل الطور المائي إلى أنبوب مخروطي نظيف آخر سعة 50 ملليلتر. أضف 7.5 ملليلتر من الماء الجزيئي ، و 35 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪ وسبعة ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من الجليكوجين.
قم بتجميد العينة المختلطة بشكل صحيح عند درجة حرارة 80 درجة سلزية تحت الصفر. أثناء تجميد العينة ، ابدأ في تنقية عينات التحكم عن طريق ضبط حجم عناصر التحكم على 500 ميكرولتر باستخدام ماء من الدرجة الجزيئية. أضف ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر RNase A واخلطه عن طريق تحريك الأنبوب.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من فينيل كلوروفورم إلى الأنابيب التي تحتوي على عناصر التحكم واخلطها عن طريق الهز. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب. بعد نقل الطور المائي إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 ملليلتر ، أضف كميات متساوية من الكلوروفورم.
أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا قبل جمع المرحلة المائية. إلى المرحلة المائية المجمعة ، أضف ملليلتر واحد من الإيثانول واثنين ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من الجليكوجين. بعد خلط العينة عن طريق الهز ، احتضانها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بطرد العينة لمدة 15 دقيقة عند 3،270 جم عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 750 ميكرولترا من الإيثانول المبرد 70٪ وأجهزة الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات المجففة بالهواء في 50 ميكرولتر من الماء الجزيئي.
يمكن تجميد التعليق هنا إذا لم يتم المضي قدما على الفور. لمتابعة تنقية عينة 3C ، قم بإزالة العينة من الفريزر وأجهزة الطرد المركزي عند 3،270 جم لمدة 30 دقيقة. أضف 10 ملليلتر من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ وقم بتفتيت حبيبات الحمض النووي.
بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، قم بتجفيف العينة جزئيا في الهواء في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من 10 ملليمولار تريس HCL عند درجة الحموضة 7.5 عن طريق السحب لأعلى ولأسفل للحصول على مكتبة 3C المنقية. ساعد QPCR الذي تم إجراؤه على عينة تجريبية واحدة وعينتين من عينات التحكم 3C في توليد بيانات كفاءة الهضم.
كان لعينة 3C كفاءة هضم تقارب 88٪ عبر المواقع الجينومية السبعة التي تم اختبارها.
