Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

خذ التقاط تأكيد الكروموسوم أو عينة 3C والضوابط ، وقم بإجراء QPCR. قم باستبعاد نطاقات المنتج المقابلة لحجم الجزء المتوقع. لإجراء استخراج هلام من منتجات PCR ، استخدم مجموعة تجارية أو اتبع البروتوكول محلي الصنع.

بالنسبة للأخير ، قم ببناء خرطوشة تنقية محلية الصنع عن طريق إحداث ثقب في قاع أنبوب 0.5 ملليلتر بإبرة. قم بتعبئة كمية صغيرة من القطن في قاع الأنبوب بالفتحة ، ولا تملأ أكثر من نصف الأنبوب. ضع الأنبوب في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، مع التأكد من أن الأنبوب الأصغر يستقر على شفة الأنبوب الأكبر ، وليس في الأنبوب.

قطع بعناية جزء هلام إلى قطع أصغر ، ووضعها في أنبوب صغير من الخرطوشة. ضع التجميع في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة خمس دقائق. ثم ، قم بتدوير التجميع لمدة ثلاث دقائق عند 13،000 جم ودرجة حرارة الغرفة.

تخلص من الأنبوب الصغير الذي يحتوي على حطام أغوروس ، واحتفظ بأنبوب 1.5 ملليلتر مع الحمض النووي المستخرج في المخزن المؤقت. تم اختبار العينات لوجود اتصالات كروماتين طويلة المدى بين المواقع الجينومية المختلفة ، باستخدام مجموعات من البادئات الخاصة بالمواقع و QPCR. ونسبت وفرة المنتج إلى مجموعة أولية للتحكم تم حسابها وتطعيمها للمقارنة.

أشارت البيانات إلى أن 8 من 10 ردود فعل كانت إيجابية مشروطة. تنقية الجل وتسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقع للثمانية الموجبة الشرطية ورد فعل سلبي واحد تم تنقية الهلام وتسلسله. يتم عرض نتائج ردود الفعل الإيجابية والسلبية التمثيلية.