للبدء ، قم بإعداد ملليلتر من 4٪ فورمالين أو أي مثبت مناسب آخر. احتفظ أيضا بطبق بتري والملقط والمقص الجراحي جاهزا قبل بدء الإجراء. ضع الأسماك المصابة بالتبريد في طبق بتري يحتوي على ماء منزوع الأيونات.
باستخدام المقص ، قم بإجراء قطع عبر الجسم ، الأمامي والخلفي إلى السويقة الذيلية. دع الأنسجة تنزف في الماء منزوع الأيونات داخل طبق بتري. باستخدام الملقط ، قم بجمع ونقل السويقة الذيلية إلى المحلول المثبت المحضر في أنبوب طرد مركزي دقيق.
اقلب الأنبوب بعناية عدة مرات. قبل التركيب ، اغسل الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق على الروك. ثم قم بنقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مليلتر يحتوي على محلول 30٪ سكروز في ماء منزوع الأيونات ، يتم تبريده مسبقا إلى أربع درجات مئوية وقلب الأنبوب برفق عدة مرات.
اترك الأنبوب في وضع مستقيم عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل. املأ قالب التضمين بطبقة خمسة ملليمترات من وسط تركيب OCT. باستخدام الملقط ، ضع السويقة الذيلية في أسفل القالب.
اضبط اتجاهه للمقاطع المستعرضة أو الإكليلية. دع الوسط يتجمد في صندوق من الثلج الجاف. بمجرد استقرار الأنسجة في الموضع المطلوب ، املأ بقية القالب قبل أن يتجمد OCT تماما.
قم بتخزين القالب على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تقسيم الأنسجة باستخدام جهاز التبريد. تم تحليل مدى الإصابة بالتبريد في أيام مختلفة بعد الإصابة بالتبريد ، أو DPCI ، في أقسام السويقة الذيلية باستخدام تلطيخ ثلاثي الألوان يتكون من Aniline Blue و Acid Fuschinو Orange-G. تم تحديد المناطق المتضررة من خلال عدم وجود تلطيخ برتقالي.
عند 4 و 7 نقطة في البوصة ، أظهر القسم المستعرض عضلات هيكلية متدهورة على نطاق واسع في الجانب المصاب بالتبريد من الجسم. أظهر تحليل التألق المناعي أنه عند 4 DPCI ، احتوى الجانب المصاب من السويقة الذيلية على خلايا إيجابية DAPI وفيرة ولكن القليل من F-actin و tropomyosin 1 ، مما يشير إلى تدهور العضلات. عند 7 نقطة في البوصة ، يمكن اكتشاف التروبوميوسين 1 و F-actin في الجرح ، بالقرب من خط الوسط الرأسي للجسم ، مما يشير إلى بدء تكوين ألياف عضلية جديدة.
عند 30 نقطة في البوصة ، أظهر كلا جانبي الجسم توزيعا مشابها لتلطيخ F-actin ، مما يشير إلى استعادة العضلات الهيكلية بكفاءة.
