Yeast Cell Culture and Cell Harvesting for Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification

ابدأ بتلقيح سلالات الخميرة المختصة بالتحكم وإعادة التركيب من ألواح YPD إلى خمسة ملليلتر من وسط YPR ، وقم بتنمية الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتوسيع نطاق الثقافة عن طريق تلقيح ملليلتر إلى 100 ملليلتر من وسط YPR الطازج وزراعته بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. لكل سلالة ، قم بتوزيع 1،800 ملليلتر من وسط خميرة الأوتوكلاف بيبتون ، و 200 ملليلتر من الأوتوكلاف 20٪ محلول رافينوز في قارورتين Erlenmeyer سعة 5 لتر.

قم بتلقيح كل سلالة من الخميرة بكثافة بصرية 0.2 عند 600 نانومتر في الوسط المعني ، واحتضانها لمدة ست ساعات عند 200 دورة في الدقيقة ، أو حتى تصل الخلايا إلى الكثافة البصرية المطلوبة 1.0. أضف 200 ملليلتر من 2٪ جالاكتوز و 110 ميكرولتر من عامل تزاوج الخميرة ألفا أو YMFA في وقت واحد لإيقاف الخلايا في المرحلة G1 واحتضانها لمدة ساعتين. نقل تعليق الخلية إلى دلاء الطرد المركزي لتر واحد وأجهزة الطرد المركزي دلو في 6،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلية في 10 إلى 15 ملليلتر من الماء المقطر. بعد ذلك ، أغلق حقنة سعة 25 ملليلتر بسدادة إغراء وضعها داخل أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مملوء بالماء. نقل تعليق الخلية إلى مجموعة حقنة.

اغسل دلاء الطرد المركزي بخمسة ملليلتر من الماء المقطر لجمع الخلايا المتبقية. ثم ، أجهزة الطرد المركزي التجميع في 2،397 G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. ثم قم بإزالة سدادة الإغراء من المحقنة وقذف الخلايا إلى نيتروجين سائل لتشكيل معكرونة خلوية.

أخيرا ، انقل السباغيتي الخلوية المجمدة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وقم بتخزينه في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى.