حرر مجمعات حلقة الكروماتين lexA CBP من الخرزات المغناطيسية المستخدمة لتنقية موضع جين الكروماتين أحادي النسخة عن طريق احتضان النحل باثنين ميكرولتر من فيروس حفر التبغ المؤتلف 6xHis أو بروتياز TEV. بعد فصل النحل عن الشطف النهائي باستخدام نقل رف مغناطيسي ، يتم توصيل الشطف المحتوي على حلقات كروماتين مشقوقة إلى أنبوب تفاعل جديد سعة 1.5 ملليلتر. مرة أخرى ، ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لفصل الخرزات المتبقية عن الشطف النهائي.
أعد تعليق الخرزات في 750 ميكرولتر من محلول كربونات الأمونيوم البارد قبل تخزين بعض العينات عند 20 درجة مئوية لتحليل الحمض النووي والبروتين. من الشطف النهائي ، أخرج العينات وقم بتخزينها عند 20 درجة مئوية لتحليل الحمض النووي والبروتين. علاوة على ذلك ، خذ عينات من الخرز المتبقي.
ابدأ شطف التمسخ بغسل الحبيبات المغناطيسية مرتين في 750 ميكرولتر من محلول كربونات الأمونيوم البارد لمدة 20 دقيقة لكل منهما ، أربع درجات مئوية تدور بسرعة 20 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 هيدروكسيد الأمونيوم المولي إلى الخرز لاستخراج مجمعات كروماتين lexA المرتبطة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افصل الخرزات عن التعليق باستخدام رف مغناطيسي وانقل الشطف إلى أنبوب تفاعل منخفض الربط.
احتضان أنبوب تفاعل الربط المنخفض في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وافصل الخرزات عن التعليق باستخدام رف مغناطيسي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الشطف إلى أنبوب تفاعل منخفض الربط. أعد تعليق الخرزات في 750 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات وجمع عينات لتحليل الحمض النووي والبروتين.
أخيرا ، احصل على عينات تحليل الحمض النووي والبروتين من الشطف النهائي. في الدراسة ، تم تحديد كفاءة تنقية موضع ARS316 وسلالة إعادة التركيب ومقارنتها بموضع التحكم PDC1. أظهر موضع ARS316 استردادا أقل في التدفق مقارنة ب PDC1.
على الرغم من أن جزءا صغيرا من حلقات الكروماتين ظل مرتبطا بخرز TEV بسبب انقسام البروتياز TEV غير المكتمل ، إلا أن الشطف المسخ أدى إلى استعادة موضع ARS316 بنسبة 80 إلى 90٪. يتوافق هذا مع الإثراء العالي لجزيئات ARS316 في حبات TEV وكسور شطف التمسخ عند أخذ حجم جينوم الخميرة في الاعتبار مقارنة بسلالة التحكم التي لم تظهر أي إثراء لموضع ARS316 في أي من الكسور الكمية. بعد شطف TEV ، أظهرت الحبيبات نسبة استرداد أعلى لموضع ARS316 حيث لم تكن كفاءة انقسام TEV 100٪ ، مما أدى إلى بقاء جزء صغير من حلقات الكروماتين مرتبطا بالخرزات.
ومع ذلك ، أظهر تغيير طبيعة المراوغة 80 إلى 90٪ استعادة موضع ARS316 وسلالة إعادة التركيب المقابلة للتخصيب العالي لجزيئات ARS316 عند أخذ حجم جينوم الخميرة في الاعتبار.
