للبدء ، خذ الدماغ المعزول عن جراء الفأر الرحيم وضعه في طبق بتري طوله ثلاثة سنتيمترات يحتوي على MEM بارد مع EBSS و 2X PSN. تحت نطاق تشريح ، افصل نصفي الكرة المخية ، وقم بإزالة وتجاهل الدماغ المتوسط والحصين والسحايا. ضع نصفي الكرة القشرية في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من MEM EBSS مع 2X PSN ، واحتفظ به على الجليد.
في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بشفط الوسائط من الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر باستخدام ماصة ، مع ترك قطع الأنسجة القشرية في الأسفل. أضف 10 ملليلتر من وسائط التفكك الدافئة مسبقا باستخدام ماصة زجاجية مطلية ، وسحن الأنسجة من 10 إلى 20 مرة. انقل المعلق إلى دورق سعة 50 ملليلتر يحتوي على قضيب تقليب صغير وضعه على طبق تحريك.
ثم أزل الكأس الزجاجية ، واضبطها بزاوية 30 درجة لمدة ثلاث دقائق للسماح للأنسجة بالاستقرار ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلترا على الجليد. جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي 50 ملليلتر عند 1000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. استبدل المادة الطافية بوسط نمو دبقي وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
طبق الخلايا بكثافة مليون في أطباق معالجة بزراعة الخلايا 10 سم واحتضانها لمدة 24 ساعة. ثم استبدل الوسائط بوسائط دبقية جديدة واسمح للخلايا بالوصول إلى التقاء 100٪ في غضون أسبوعين قبل طلائها للتجربة. صفيحة 100،000 خلية دبقية لكل بئر في ستة ألواح جيدة وتسمح لهم بالوصول إلى التقاء 80٪ إلى 100٪ لعدوى البريون في المختبر.
تعريض 20٪ من متجانسات الدماغ المخففة و PBS للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. استنشاق الوسائط من الخلايا الدبقية المراد إصابتها وإضافة 1.5 إلى 2 ملليلتر من وسائط النمو الدبقية مع 0.1٪ من تجانس الدماغ الطبيعي أو البريون لكل بئر. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الوسائط ، وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وإضافة وسائط نمو دبقية جديدة.
استنشاق الأنسجة الدهنية بعناية في حوالي ملليلتر واحد من HBSS في محلول التربسين 0.25 ٪ ، وذلك باستخدام ماصة مصلية. انقل الأنسجة إلى طبق بتري طوله أربعة سنتيمترات يحتوي على ملليلتر من وسائط DMEM F-12 مع خليط Dnase-1 وكولاجيناز وديسباز. ثم قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة باستخدام مقص واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
نقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، سحن الأنسجة، وبيليه جزء الأوعية الدموية اللحمية، والتي سوف تظهر حمراء. بعد غسل الحبيبات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم والطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسائط ADMSC. بعد ذلك ، ماصة تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر ، لإزالة الأنسجة غير المنفصلة.
أضف تسعة ملليلتر من وسائط ADMSC إلى طبق معالج بزراعة الخلايا بطول 10 سم. ماصة تعليق الخلية المتوترة فيه واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي وقم بتمرير الخلايا بمجرد وصولها إلى التقاء 80٪ إلى 90٪.
بعد أن تخضع الخلايا لمرورين إلى ثلاثة ، أعد تعليقها في ثلاثة إلى 10 ملليلتر من الوسائط وعد باستخدام مقياس الدم. لوحة 100،000 خلية لكل بئر في ستة ألواح تحتوي على وسائط ADMSC واحتضانها بين عشية وضحاها ، كما هو موضح سابقا. في اليوم التالي ، قم بإعداد وسائط ADMSC للخلايا المحفزة بالسيتوكين إما ب 10 نانوجرام لكل ملليلتر من TNF-alpha أو 200 نانوجرام لكل ملليلتر من IFN-gamma.
إنشاء وسائط ADMSC بتركيز نهائي بنسبة 0.1٪ مصاب بالبريون أو تجانس دماغي طبيعي لعينات التحكم. استنشاق الوسائط القديمة ، وإضافة 1.5 ملليلتر من السيتوكين أو الوسائط المحتوية على تجانس الدماغ في الآبار المقابلة في ثلاث نسخ ، وإعادة الألواح إلى الحاضنة. ثم اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وعزل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من محلول التحلل مع 1٪ بيتا ميركابتوإيثانول إلى كل بئر.
قم بإزالة محللات الخلايا باستخدام رافع الخلية ونسخ عكسي 25 نانوجرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة وتضخيم الحمض النووي التكميلي. لوحة BV2 الخلايا الدبقية الصغيرة عند 50،000 خلية لكل بئر أو الدبقية المختلطة الأولية عند 100،000 خلية لكل بئر في لوحة من ستة آبار. عالج خلايا BV2 بوسائط تحتوي على 0.1٪ مصاب بالبريون أو متجانسة دماغية طبيعية واحتضانها لمدة 72 ساعة.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة تجانس الدماغ المتبقي. أضف وسائط جديدة إلى الخلايا وأعد اللوحة إلى الحاضنة. لتحفيز ADMCs ، عالجها ب 10 نانوجرام لكل ملليلتر من TNF-alpha لمدة 24 ساعة قبل الزراعة المشتركة مع BV2 أو الخلايا الدبقية المختلطة.
اغسل ADMCs المحفزة باستخدام PBS ثلاث مرات وقم بتدوير تعليق ADMSC كما هو موضح سابقا. استبدل الوسائط الموجودة على خلايا BV2 أو الخلايا الدبقية المختلطة بملليلتر لكل بئر من وسائط ADMSC ، وضع إدخالات لألواح ستة آبار بحجم مسام 0.4 ميكرومتر في نصف الآبار. أضف ملليلتر من وسائط ADMSC إلى كل ملحق وأضف مليلتر إضافيين من الوسائط إلى الآبار التي لا تتلقى إدراجات.
عند التكوير, إعادة تعليق وعد ADMCs, أضف 50,000 إلى 100,000 خلية لكل إدراج واحتضانها. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الإدخالات والتخلص منها أو استبدالها في لوحة جديدة من ستة آبار وغسل الإدخالات مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف المخزن المؤقت الذي توفره مجموعة عزل الحمض النووي الريبي إلى الخلايا الدبقية المختلطة أو خلايا BV2 وكشط الآبار.
