ابدأ بإعداد جميع الكواشف قبل التجربة وقم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. ثم تحضير وسط طبقة الفئران أحادي الطبقة. قم بتخفيف الغشاء القاعدي المذاب من واحد إلى 20 باستخدام وسط أحادي الطبقة البارد ، واحتفظ به على الجليد.
ضع حشوة زراعة خلايا شفافة 0.4 ميكرومتر ، باستخدام ملقط معقم ، في بئر واحدة من صفيحة زراعة الأنسجة 24 بئرا. أمسك بشق زاوية من الملحق وانقله إلى البئر. كرر حتى يتوفر العدد المناسب من إدخالات زراعة الخلايا للثقافة.
لتغطية السطح القمي لكل ملحق مزرعة خلية بمصفوفة غشاء قاعدي مخففة ، ضع طرف ماصة P 200 في وسط الإدخال وطرد مصفوفة 150 ميكرولتر. ثم ، انقل اللوحة إلى حاضنة معقمة 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة ساعة على الأقل. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير لوحة البئر 24 بزاوية 45 درجة.
ضع إصبعا واحدا على زاوية الشق لتثبيت الإدخال. ضع طرف الماصة P 200 برفق على طول الجانب السفلي من الملحق وقم بإزالة مصفوفة الطابق السفلي. قم بإزالة أي بقايا زائدة عن طريق غسل كل ملحق مزرعة خلية ب 150 ميكرولتر من DPBS المعقم بدون أيونات الكالسيوم أو المغنيسيوم واتركها تجف في خزانة أمان بيولوجي لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
بمجرد تجفيف الحشوات ، أضف 400 ميكرولتر من وسط طبقة الفئران الأحادية إلى الأسفل ، و 75 ميكرولترا فوق ملحق زراعة الخلية. كرر حتى يتم غمر جميع إدراج ثقافة الخلية. اترك اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية أو الحاضنة لحين الحاجة.
ثم قم بإزالة 24 صفيحة بئر من القولون المعوي الناضج من الحاضنة وضعها تحت خزانة السلامة البيولوجية. نضح الوسط باستخدام أطراف معقمة واغسل كل بئر بمليلتر واحد من DPBS المعقمة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام نصائح معقمة ، قم بإزالة DPBS بدون أيونات الكالسيوم أو المغنيسيوم.
هضم كل سدادة من مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من كاشف التفكك الأنزيمي في كل بئر ليتم مرورها. لتفتيت القابس ، قم بتدوير لوحة البئر 24 بزاوية 45 درجة. ضع طرف الماصة على حافة القابس وقم بإزاحته برفق عن طريق سحب كل قابس حوالي ست إلى 10 مرات.
ضع صفيحة البئر 24 مرة أخرى في حاضنة معقمة عند 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. بعد الحضانة ، ماصة التربسين صعودا وهبوطا خمس إلى سبع مرات لكل بئر تحت خزانة السلامة البيولوجية. انقل القولون المنفصل من كل بئر إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر واحضر ما يصل إلى 10 ملليلتر باستخدام وسيط غسيل فأر بارد مثلج.
بعد ذلك ، يقوم جهاز الطرد المركزي بهضم القولون جزئيا عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. تحت خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإزالة المادة الطافية من الحبيبات باستخدام ماصة 10 ملليلتر. أيضا ، قم بإزالة أي وسيط متبقي باستخدام ماصة P 200.
ثم أعد تعليق حبيبات القولون بإضافة 75 ميكرولترا من وسط الفئران أحادي الطبقة. استغني عن 75 ميكرولترا من معلق القولون في مركز كل ملحق مزرعة خلوية. ماصة التعليق برفق مرة أو مرتين قبل إضافته إلى البئر لضمان طلاء موحد.
ضع صفيحة البئر 24 مع إدراج زراعة الخلايا على منصة دوارة لمدة 10 دقائق للسماح بتشتت موحد عبر إدخال زراعة الخلية ، قبل وضع اللوحة في 37 درجة مئوية معقمة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في نهاية الحضانة ، تم إزاحة شظايا القولون غير المرتبطة عن طريق وضع الطرف بجانب الجزء الداخلي من ثقافة الخلية وسحب الوسط ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة P 200. تجنب تعطيل الخلايا المعوية المرفقة.
قم بإزالة الخليط المتوسط والقولون على الفور. كرر حتى يتم تنظيف جميع إدخالات زراعة الخلايا. أضف الآن 150 ميكرولترا من وسط أحادي الطبقة للفأر المسخن مسبقا إلى الجانب القمي لكل إدراج لثقافة الخلية.
أضف 400 ميكرولتر من وسط أحادي الطبقة من الفئران الدافئة إلى كل بئر من 24 صفيحة بئر جديدة. انقل ملحق زراعة الخلايا إلى اللوحة الجديدة عن طريق الإمساك بشقها باستخدام ملقط معقم. قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى يتم الوصول إلى الالتقاء المطلوب.
ظهرت القولونات المعطلة إنزيميا المطلية على إدخالات زراعة الخلايا في البداية في مجموعات خلوية تتراوح من 15 إلى 150 خلية. في اليوم الثالث ، تم تسطيح الخلايا وغطت ببطء إدخال مزرعة الخلية ، ووصلت بشكل عام إلى نقطة التقاء. خلال اليومين التاليين ، استمرت الطبقات الأحادية في النمو وشكلت حاجزا مستمرا يمكن قياسه كميا.
