ابدأ بسحب قطرة واحدة من محلول الحجب الجاهز للاستخدام مع مصل الحمير على عينات الأنسجة. ثم احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الحظر الزائد من الشرائح عن طريق النقر على الحافة على سطح صلب.
خفف الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة لتحضير 100 ميكرولتر من المحلول النهائي لكل عينة. قم بإعداد الأجسام المضادة ، أنبوب واحد لكل جسم مضاد أساسي وواحد لكل جسم مضاد متساوي التحكم. انشر بالتساوي 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة isocontrol على عينة واحدة ، و 100 ميكرولتر من الميلوبيروكسيديز وهيستون سيترولين H3 ، أو تخفيف الأجسام المضادة للمايلوبيروكسيديز والعدلات الإيلاستاز على العينة الأخرى.
ضع الشرائح في غرفة مبللة وقم بتخزينها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة من الشرائح وقم بتكديسها في كوفيت. اشطف الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام محلول ملحي مؤقت Tris مع توين لإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي المتبقي.
قم بإعداد اثنين من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية بشكل واضح ، حمار مضاد للماعز ل myeloperoxidase ومضاد للأرانب للحمار لتلطيخ هيستون H3 الحمضي. تمييع كل جسم مضاد إلى 7.5 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة. ضع الشرائح في حجرة مبللة ووزع 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي على كل عينة.
احتضانهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي الزائد عن طريق النقر على الشرائح. ضع الشرائح في رف شرائح.
اغمر الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في جرة ملطخة مملوءة ب PBS لغسل الأجسام المضادة غير المقيدة. تحضير محلول dappy وتخفيفه إلى تركيز ميكروغرام واحد لكل ملليلتر مع الماء منزوع الأيونات. اغمر الرف المنزلق في جرة تلطيخ تحتوي على محلول دابي واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
بعد ذلك ، اغمر رف الشرائح في جرة تلطيخ باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لغسل أي محلول دهني زائد. أخيرا ، قم بتركيب العينات باستخدام زلات الغطاء ووسيط التركيب. يرتبط الجسم المضاد H3 هيستون السيترولين فقط بالهستونات خارج الخلية ولم يظهر أي تلطيخ للهستونات داخل الخلايا.
لم يظهر الجسم المضاد للميلوبيروكسيديز الخاص بالإنسان أو الفأر أي تلطيخ محدد. بينما أظهرت الأجسام المضادة العالمية للإنسان والفأر تلطيخا جيدا ثابتا للمايلوبيروكسيداز. عندما لم يتم استخدام أي عامل مانع ، أظهرت بعض عينات الفئران تلطيخا إيجابيا غير محدد وجزئي.
عند الحظر ، أظهر وقت الحظر لمدة خمس دقائق نتائج جيدة مقارنة بوقت الحظر البالغ 10 دقائق. أظهرت درجات الحرارة المرتفعة في الميكروويف والحمام المائي استرجاع مستضد معتدل إلى جيد باستمرار. بينما في حمام مائي 60 درجة مئوية كان هناك جزئيا فقط إيجابي أو لا تلطيخ.
للتلطيخ المزدوج ، تم الحصول على نتائج أكثر ملاءمة للعينات المحتضنة عند حمام مائي 96 درجة مئوية. ومع ذلك ، فإن تجاوز وقت الحضانة البالغ 40 دقيقة عند 96 درجة مئوية أدى إلى تلطيخ أقل كثافة للأجسام المضادة.
