تأسست هذه الأبحاث من قبل جمعية الأبحاث الألمانية (BO5534). نشكر أنطونيا كيويت وموريتز لينز ويوهانا هاجنز والدكتورة أنيكا هوير والأستاذة العامة الدكتورة إنغو كونيغس على تزويدنا بالعينات. بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون فريق مرفق التصوير المجهري UKE (المرفق الأساسي ، كلية الطب UKE) على الدعم في الفحص المجهري المناعي.

شملت هذه الدراسة أنسجة الفئران المشتقة من التجارب المعتمدة من قبل إدارة ولاية هامبورغ للبحوث الحيوانية ، Behörde für Justiz und Verbraucherschutz ، هامبورغ ، ألمانيا (73/17 ، 100/17 ، 94/16 ، 109/2018 ، 63/16). كانت الأنسجة المستخدمة هي رئة الفأر والقولون من نموذج الصرف الصحي والجلد المحترق. استخدمنا الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اتباع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية لجميع التجارب. تضمنت العينات البشرية مجهولة المصدر أنسجة من التهاب الأمعاء والقولون الوليدي ، والجلد المحروق ، ورتق القناة الصفراوية ، والتهاب الفقار ، وعضلة القلب. وفقا للجنة أخلاقيات البحوث الطبية في هامبورغ ، لم تكن العينات بحاجة إلى موافقة مستنيرة ، ولكن تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة (WF-026/21).
1. تثبيت العينة
<ol><li>استخدم البروتوكول التالي المشتق من أبو عابد وبرينكمان لتثبيت العينات ، والجفاف ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتركيب3،15.<ol><li>تحضير محلول الفورمالديهايد 4٪ عن طريق إذابة 40 جم من بارافورمالدهايد (PFA) في 800 مل من محلول ملحي مخزن Tris ، درجة الحموضة 7.4 (TBS).</li>
		<li>يقلب المزيج على حرارة 60 درجة مئوية تحت غطاء دخان حتى يذوب PFA. أحضر المحلول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، واضبط مستوى الصوت باستخدام TBS إلى 1000 مل.</li>
		<li>اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. يخزن في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.</li>
	</ol></li>
	<li>لتثبيت العينة، ضع الأنسجة الطازجة في محلول TBS، وقم بتشليلها إلى قطع أصغر من 20 مم × 30 مم × 3 مم. اغمر أقسام الأنسجة في محلول بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 12-24 ساعة. ملاحظة: استخدم البروتوكول الأصلي محلول PFA بنسبة 2٪ ووقت تثبيت من 8-20 ساعة. مع هذه الطريقة ، لم يتم تثبيت بعض أقسام الأنسجة بالكامل بعد 20 ساعة ، لذلك تم زيادة تركيز PFA إلى 4٪ PFA.</li>
	<li>نقل العينات إلى أشرطة معالجة الأنسجة الملصقة. استخدم أقلام تحديد أو أقلام رصاص مقاومة للمذيبات لوضع العلامات.</li>
	<li>ابدأ تجفيف العينة عن طريق غمر الكاسيت في 70٪ إيثانول لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، انغمس في 80٪ إيثانول ، و 90٪ إيثانول ، و 96٪ إيثانول ، ومرتين في 100٪ إيثانول ، مع كل خطوة تدوم 1 ساعة.</li>
	<li>اغمر مرتين في 100٪ زيلين (ثنائي ميثيل بنزين) ثم مرتين في 60 درجة مئوية من البارافين لمدة 1 ساعة في كل مرة.</li>
	<li>استخدم قوالب التضمين للتركيب ، واترك البارافين يتجمد قبل إزالة القالب.</li>
	<li>استخدم ميكروتوم لقطع أقسام الأنسجة السميكة 3 ميكرومتر.</li>
	<li>استخدم الملقط لوضع الأجزاء المقطوعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، واتركها تطفو على السطح لتمديد جروح الأنسجة.</li>
	<li>ضع الأقسام على شرائح زجاجية لاصقة (جدول المواد) ، واتركها تجف طوال الليل في غرفة حرارة 40 درجة مئوية.</li>
</ol>2. عينة الإماهة
<ol><li>لإزالة البارافين ، قم بتكديس الشرائح في رف منزلق ، واغمرها مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في الليمونين المتوسط البديل للزيلين (جدول المواد) ومرة واحدة لمدة 5 دقائق في خليط 1: 1 ليمونين / إيثانول. تنبيه: الليمونين قابل للاشتعال عند 50 درجة مئوية ويمكن أن يسبب الحساسية. استخدميه تحت غطاء الدخان مع حماية العين والقفازات. الابتعاد عن إطلاق النار.</li>
	<li>أعد ترطيب العينات في سلسلة إيثانول تنازلية عن طريق غمر الرف المنزلق مرتين في إيثانول 100٪ ومرة واحدة في 96٪ إيثانول و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول و 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في ماء منزوع الأيونات (ماء DI) لتنظيف أي إيثانول متبقي.</li>
</ol>3. حجب التألق الذاتي واسترجاع المستضد
<ol><li>قم بإعداد محلول استرجاع الهدف pH 6 citrate (TRS) (جدول المواد) وفقا لورقة البيانات. يتركز هذا TRS 10 مرات. لذلك ، تمييع 1:10 بالماء DI. سخني في برطمان بلاستيكي إلى 96 درجة مئوية. ملاحظة: يكسر TRS جسور الميثيلين التي تشكلت أثناء تثبيت العينة لكشف حوامل المستضد. وهذا يسمح للأجسام المضادة الأولية بربط مولد الضد المستهدف. يخزن TRS المركز في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة 8 أشهر. قم دائما بإعداد TRS الطازجة.</li>
	<li>أخرج الشرائح من رف الشرائح ، وضعها في غرفة مبللة. ماصة قطرة إلى قطرتين من عامل تقليل التألق الذاتي (جدول المواد) على كل عينة. احتضان لمدة 5 دقائق. ملاحظة: يمنع عامل الحد من التألق الذاتي التألق الذاتي للأنسجة المتأصلة الناجم عن الفلوروفورات الداخلية والمثبتات. قم بتخزين عامل تقليل التألق الذاتي في RT لمدة تصل إلى 1 سنة. ملاحظة: العمل فقط مع أقسام صغيرة من الأنسجة لتجنب جفاف العينات أو تجاوز وقت الحضانة.</li>
	<li>قم بتكديس الشرائح مرة أخرى في رف الشرائح ، واشطفها لمدة 1 دقيقة في 60٪ من الإيثانول باستخدام حركة تصاعدية وهبوطية حتى يتم غسل كل كاشف تقليل التألق الذاتي غير المستخدم.</li>
	<li>اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في ماء DI.</li>
	<li>لاسترجاع المستضد ، انقل الشرائح إلى جرة تلطيخ باستخدام TRS المسخن مسبقا. احتضان لمدة 10 دقائق على 96 درجة مئوية في حمام مائي. ملاحظة: يمكن استبدال حمام الماء 96 درجة مئوية بميكروويف أو طباخ بخار إذا تم تسخين TRS مسبقا إلى 96 درجة مئوية وتم ضمان 10 دقائق من وقت الحضانة عند 96 درجة مئوية.</li>
	<li>أخرج برطمان التلوين واتركه يبرد ببطء إلى RT لمدة 60-90 دقيقة تقريبا. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة تصل إلى 4 ساعات ، مع ترك الشرائح في TRS.</li>
	<li>قم بإزالة TRS ، ولكن احتفظ بالشرائح في الجرة. اشطفيه مرتين بمحلول ملحي مخزن من Tris مع 0.05٪ توين (TBST ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 دقائق لكل منهما لغسل أي بقايا TRS متبقية.</li>
	<li>للنفاذية ، قم بإعداد 0.2٪ Triton في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، واملأه في جرة التلوين لنفاذ العينات لمدة 10 دقائق. ملاحظة: يعزز النفاذية ارتباط الأجسام المضادة الأولية بالبروتينات المستهدفة داخل الخلايا في العينات الثابتة.</li>
	<li>شطف الشرائح مرة أخرى مرتين في TBST لمدة 3 دقائق في كل مرة.</li>
	<li>تحضير الغرفة الرطبة ، ووضع الشرائح. امسح الماء الزائد من الشرائح بمناديل ورقية. ضع دائرة حول كل عينة باستخدام قلم حاجز كاره للماء لمنع محلول الجسم المضاد من الجريان. ملاحظة: لا تدع العينات تجف. من الأفضل العمل مع أقسام صغيرة.</li>
</ol>4. منع ربط الأجسام المضادة غير المحددة
<ol><li>خذ محلول مانع جاهز للاستخدام مع مصل الحمير (جدول المواد) ، وماصة قطرة واحدة على كل عينة. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT. ملاحظة: تقلل خطوة الحظر هذه من ارتباط الجسم المضاد الثانوي بمواقع ربط غير محددة على العينة. بعد منع هذه الحواتم غير المتخصصة وتطبيق الجسم المضاد الأولي ، سيرتبط الجسم المضاد الثانوي بالجسم المضاد الأولي ولن يتفاعل مع سطح النسيج. يتم تخزين كاشف الحجب الجاهز للاستخدام في 2-8 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.</li>
	<li>قم بإزالة محلول الحظر الزائد من الشرائح عن طريق النقر على حافة الشرائح على سطح صلب. لا تشطفها.</li>
</ol>5. الأجسام المضادة الأولية
<ol><li>تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد). استخدم ما يقرب من 100 ميكرولتر من المحلول النهائي لكل عينة. بالنسبة للجسم المضاد NE و H3cit (R8) والتحكم في الأيزوكونترول ، قم بتخفيفه إلى تركيز 5 ميكروغرام / مل. بالنسبة ل MPO والتحكم في الأيزوكونترول المقابل ، استخدم 10 ميكروغرام / مل. قم بإعداد أنبوب واحد لكل جسم مضاد أولي وأنبوب واحد لكل جسم مضاد متساوي التحكم. ملاحظة: يمكن دمج H3cit (R8) / MPO أو NE / MPO وعناصر التحكم الخاصة بهم لتلطيخ NETs. بالنسبة لمزيج H3cit (R8) / MPO ، خفف إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل ل H3cit (R8) و 10 ميكروغرام / مل ل MPO إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى NE / MPO ، خفف إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل ل NE و 10 ميكروغرام / مل ل MPO إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى isocontrol ، استخدم نفس التركيز لكل جسم مضاد مقابل. استخدم دائما طرف ماصة جديدا لكل جسم مضاد مستخدم. يمكن تخزين الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع وعند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.</li>
	<li>مع عينتين على شريحة واحدة ، استخدم واحدة للأجسام المضادة isocontrol والأخرى لتخفيف الأجسام المضادة MPO / H3cit أو MPO / NE. استخدم ما يقرب من 100 ميكرولتر لكل عينة ، وانشر محلول الأجسام المضادة بالتساوي. ملاحظة: لا تدع العينات تجف. كن حذرا لتجنب الخلط بين الأجسام المضادة المتساوية والأجسام المضادة الأولية.</li>
	<li>يحفظ في حجرة مبللة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>في اليوم التالي ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة من الشرائح ، وقم بتكديس الشرائح في كوفيت. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع TBST لغسل محلول الأجسام المضادة الأولية المتبقية.</li>
</ol>6. الأجسام المضادة الثانوية
<ol><li>تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية. استخدم اثنين من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المختلفة: حمار مضاد للماعز ل MPO ومضاد للأرانب للحمار لتلطيخ H3cit. قم بتخفيف كل واحد إلى تركيز 7.5 ميكروغرام / مل باستخدام محلول تخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد). ملاحظة: للتلطيخ المزدوج ، استخدم جسمين مضادين فلوريين بمناطق إثارة مختلفة والحد الأدنى من التداخل الطيفي. الجمع بين كل من الأجسام المضادة الثانوية ، وتخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 7.5 ميكروغرام / مل لكل جسم مضاد لحجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. حماية الأجسام المضادة من الضوء. يمكن تخزين الأجسام المضادة الثانوية في 2-8 درجة مئوية لمدة 6-8 أسابيع أو في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.</li>
	<li>احتفظ بالشرائح في الحجرة الرطبة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل عينة. دعهم يحتضنون لمدة 30 دقيقة في RT ومحميين من الضوء.</li>
	<li>اضغط على محلول الأجسام المضادة الثانوية الزائدة ، وقم بتكديس الشرائح في رف الشرائح. اغمر ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في جرة ملطخة مملوءة ب PBS لغسل أي أجسام مضادة غير مقيدة متبقية.</li>
	<li>تحضير محلول DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) (جدول المواد) ، وتخفيفه إلى تركيز 1 ميكروغرام / مل مع ماء DI. اغمر الرف المنزلق في جرة تلطيخ بمحلول DAPI ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. ملاحظة: يستخدم DAPI كصبغة فلورية للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. يمكن استخدام حل DAPI المحضر عدة مرات. قم بتخزين حل DAPI المعد في RT. يمكن تخزين مركز DAPI في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.</li>
	<li>اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في وعاء تلطيخ باستخدام برنامج تلفزيوني لغسل محلول DAPI الزائد.</li>
</ol>7. تركيب وتخزين العينات والتحليل المجهري
<ol><li>قم بتركيب العينات باستخدام أغطية ووسط تركيب (جدول المواد). ملاحظة: استخدم كميات صغيرة فقط من وسيط التركيب ، وامسح الوسط الزائد بمناديل مبللة. ارتد القفازات ، وتجنب مسح أي وسيط عن طريق الخطأ من أغطية الغطاء أو الشرائح. تجنب تكوين الفقاعات ، واستخدم مسحات القطن للضغط برفق على أغطية الغطاء لإزالة أي فقاعات من الشرائح.</li>
	<li>للتصوير ، استخدم مجهرا واسع المجال أو مجهرا متحد البؤر. ملاحظة: التقط صورة لعنصر التحكم المتماثل أولا. قم بتقليل وقت التعرض لمرشحات التألق (باستثناء المرشح الأزرق ل DAPI) حتى لا يمكن اكتشاف أي إشارة تقريبا. ثم استخدم هذا الإعداد لفحص العينات المقابلة. ابحث عن المناطق التي يمكن فيها اكتشاف إشارة الفلورسنت في كل عينة فردية باستخدام قناة التألق. بعد التقاط صورة للمنطقة ، يقوم البرنامج بإنشاء صورة مركبة لجميع القنوات ويظهر إشارات مضان مختلفة كتداخل بألوان مختلفة. يمكن بعد ذلك تحليل الصورة بشكل أكبر للتوطين المشترك مع برامج التصوير مثل ImageJ.</li>
	<li>قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.</li>
</ol>

تلطيخ والتصوير لتصور مصائد العدلات خارج الخلية

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).</li><li>Kawasaki, H., Iwamuro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+histones+in+host+defense+as+antimicrobial+agents.">Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents.</a> Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).</li><li>Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+anti-Aspergillus+defense+by+neutrophil+extracellular+traps+in+human+chronic+granulomatous+disease+after+gene+therapy+is+calprotectin-dependent.">Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+neutrophil+extracellular+trap+degradation+is+associated+with+lupus+nephritis.">Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).</li><li>Papadaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+exacerbate+Th1-mediated+autoimmune+responses+in+rheumatoid+arthritis+by+promoting+DC+maturation.">Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation.</a> European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).</li><li>Toussaint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+released+by+NETosis+promotes+rhinovirus-induced+type-2+allergic+asthma+exacerbation.">Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation.</a> Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+traps+promote+thrombosis.">Extracellular DNA traps promote thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps.">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).</li><li>Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+Neutrophil+extracellular+traps+license+macrophages+for+cytokine+production+in+atherosclerosis.">Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li><li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines.">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li><li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections.">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).</li><li>de Buhr, N., von K&#246;ckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy.">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li><li>Savchenko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+form+predominantly+during+the+organizing+stage+of+human+venous+thromboembolism+development.">Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Barliya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+involvement+of+NETosis+in+inflammatory+processes+in+the+eye:+Evidence+from+a+small+cohort+of+patients.">Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients.</a> Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduced+bone+marrow+neutrophils+in+collagen-induced+arthritis+are+primed+for+NETosis:+An+ignored+pathological+cell+involving+inflammatory+arthritis.">Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis.</a> Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).</li><li>Nonokawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+neutrophil+extracellular+traps+with+the+development+of+idiopathic+osteonecrosis+of+the+femoral+head.">Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head.</a> American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).</li><li>Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+are+present+in+the+airways+of+ENaC-overexpressing+mice+with+cystic+fibrosis-like+lung+disease.">Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease.</a> BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).</li><li>Knackstedt, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+inflammatory+pathogenesis+in+malaria.">Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria.</a> Science Immunology. 4 (40), (2019).</li><li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histones+and+neutrophil+extracellular+traps+enhance+tubular+necrosis+and+remote+organ+injury+in+ischemic+AKI.">Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).</li><li>Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy.">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).</li><li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

في هذا العمل ، كنا نهدف إلى تكييف وتحسين البروتوكولات الحالية لتصوير الشبكات لمزيد من أنواع الأنسجة ، بدءا من عملية التلوين الفعلية. الخطوة الأولى الحاسمة لهذه الطريقة هي اختيار الأجسام المضادة الأكثر ملاءمة. بالنسبة إلى NE ، جربنا جسما مضادا NE من مضيف فأر على الأنسجة البشرية ، والذي لم يظ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

تم تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) لأول مرة بواسطة Brinkmann et al. كمسار للموت الخلوي يختلف عن موت الخلايا المبرمج والنخر في عام 20041. في هذا المسار ، تطلق العدلات الكروماتين غير المكثف في الفضاء خارج الخلية لتشكيل هياكل كبيرة تشبه الويب مغطاة بالبروتينات المضادة للميكروبات التي كانت مخزنة سابقا في الحبيبات أو العصارة الخلوية. تشمل هذه البروتينات المضادة للميكروبات إيلاستاز العدلات (NE) ، والميلوبيروكسيديز (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، والتي تستخدم عادة للكشف المناعي غير المباشر عن NETs2. هذه الطريقة لا تحدد فقط الوجود الكمي لهذه البروتينات. في الواقع ، لديها ميزة الكشف على وجه التحديد عن الهياكل الشبيهة بالشبكة. في الشبكات ، تتركز البروتينات المذكورة مع الحمض النووي خارج الخلية ، والذي يمكن اكتشافه من خلال تداخل الإشارات الفلورية لكل بروتين ملطخ والحمض النووي خارج الخلية. على عكس الإشارات المتداخلة بسبب الحمض النووي خارج الخلية والتوطين المشترك للبروتين في الشبكات ، لا تظهر العدلات السليمة أي توطين مشترك. هنا ، عادة ما يتم تخزين مكونات NET بشكل منفصل في الحبيبات والنوى والسيتوسول3.
منذ اكتشافها لأول مرة ، ثبت أن الشبكات تلعب دورا مركزيا في العديد من الأمراض ، لا سيما تلك التي تنطوي على التهاب. تظهر الشبكات وظائف مضادة للميكروبات أثناء العدوى من خلال محاصرة وقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة 4,5. ومع ذلك ، فقد تم ربط الشبكات أيضا بأمراض المناعة الذاتية والاستجابات المفرطة الالتهاب ، مثل الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتيزمي والربو التحسسي6،7،8. تعزز الشبكات انسداد الأوعية والالتهابات في تصلب الشرايين ، والتصاق الصفائح الدموية ، ومن المتوقع أن تلعب دورا في السرطانالنقيلي 9،10،11. ومع ذلك ، يعتقد أن لها خصائص مضادة للالتهابات عن طريق تقليل مستويات السيتوكين المسببة للالتهابات12. بينما تكتسب الشبكات اهتماما أكبر بمجال أوسع من البحث ، فإن طريقة الكشف عن NET القوية أمر أساسي للبحث في المستقبل.
على الرغم من أن تصور الشبكات في الأنسجة المختلفة باستخدام التصوير المناعي معقد ويتطلب التخصيص ، بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، إلا أنه يعد حاليا أحد أشهر الطرق لتصور التفاعلات بين الشبكات والخلايا ويستخدم في الغالب في الأنسجة المدمجة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE)13,14. ومع ذلك ، فإن مقارنة التصوير NET أمر صعب ، حيث تستخدم المختبرات المختلفة بروتوكولاتها المخصصة. تختلف هذه البروتوكولات في استخدامها للأجسام المضادة أو استرجاع المستضد أو طريقة النفاذية وغالبا ما يتم تحسينها لنوع معين من الأنسجة3،13،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26، 27.
بعد أن نشر Brinkmann et al. أول دراسة منهجية باستخدام التصور المناعي الفلوري للشبكات في أنسجة FFPE ، أردنا تحسين هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من الأنسجة والأنواع15. بالإضافة إلى ذلك ، لإنشاء بروتوكول تألق مناعي قابل للتطبيق على نطاق واسع ، اختبرنا بروتوكولات معدلة مختلفة من الدراسات التي استخدمت طرق التألق المناعي في أنسجة FFPE للكشف عن الشبكات3،13،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25 ، 26,27. علاوة على ذلك ، جربنا جسما مضادا جديدا ل H3cit لتلطيخ أكثر تحديداخارج الخلية 28. نحن نفترض أنه من خلال تكييف بروتوكولات التلوين الحالية بشكل منهجي مع الأنواع والأنسجة المختلفة ، يمكن تحسين التصوير في المختبر ، مما يؤدي إلى تمثيل أفضل للتفاعل بين العدلات والشبكات محليا ومنهجيا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

يتم إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بواسطة العدلات كاستجابة للعدوى البكتيرية أو تلف الأنسجة الرضحية ولكنها تلعب أيضا دورا في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات المعقمة. إنها هياكل تشبه الويب تتكون من خيوط الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، والهستونات ، والبروتينات المضادة للميكروبات. بمجرد إطلاقها ، يمكن للشبكات أن تحبس وتقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة. علاوة على ذلك ، تشارك الشبكات في تنظيم الاستتباب عن طريق تحفيز التصاق الصفائح الدموية وتجلطها. ومع ذلك ، فقد ارتبط الإنتاج غير المنظم للشبكات أيضا بأمراض مختلفة ، بما في ذلك الإنتان أو اضطرابات المناعة الذاتية ، مما يجعلها هدفا واعدا للتدخل العلاجي. بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، يعد تصور الشبكات باستخدام التصوير المناعي حاليا أحد الطرق الوحيدة المعروفة لإظهار تفاعلات NET في الأنسجة. لذلك ، تم استخدام طرق تلطيخ مختلفة لتصور NETs. في الأدبيات ، تم وصف بروتوكولات تلطيخ مختلفة ، وحددنا أربعة مكونات رئيسية تظهر تباينا كبيرا بين البروتوكولات: (1) أنواع الأجسام المضادة المستخدمة ، (2) استخدام عوامل تقليل التألق الذاتي ، (3) طرق استرجاع المستضد ، و (4) النفاذية. لذلك ، تم تكييف بروتوكولات التلوين المناعي في المختبر وتحسينها بشكل منهجي في هذا العمل لجعلها قابلة للتطبيق على الأنواع المختلفة (الفأر ، الإنسان) والأنسجة (الجلد والأمعاء والرئة والكبد والقلب والقرص الفقري). بعد التثبيت وتضمين البارافين ، تم تركيب أقسام بسمك 3 ميكرومتر على شرائح. تم تلطيخ هذه العينات بالأجسام المضادة الأولية ل myeloperoxidase (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، وإيلاستاز العدلات (NE) وفقا لبروتوكول تلطيخ معدل. تم تلطيخ الشرائح بأجسام مضادة ثانوية وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحليل النتائج وفقا لورقة تقييم ، وتم تسجيل الاختلافات شبه الكمية.
هنا ، نقدم بروتوكول تلطيخ صافي محسن مناسب للأنسجة المختلفة. استخدمنا جسما مضادا أوليا جديدا لتلطيخ H3cit وقللنا من تلطيخ غير محدد بعامل تقليل التألق الذاتي. علاوة على ذلك ، أثبتنا أن التلوين الصافي يتطلب درجة حرارة عالية ثابتة ومعالجة دقيقة للعينات.

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

تسليط الضوء على المؤلف: تصوير مصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر 

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر

Among antibody selection for tissue imaging, the fixation process poses a challenge by epitope masking. Therefore, customized retriever step is required to expose these antigens for antibody binding. Additionally, tissue inherent autofluorescence can cause difficulties through to a high background staining.However, the use of different approaches in the protocols in the literature hinders a standardized comparison between the images. Our study aims to address the demand for standardized procedures and assist the researcher in overcoming challenges during the imaging process. We established a versatile imaging protocol applicable to different tissues by comparing various different protocols.So our work provides guiding and troubleshooting tips from antibody usage to sample mounting, highlighting the potential pitfalls. Our findings advance research by introducing a new primary antibody for citrullinated hisone three, and an autofluorescent reducing agent to minimize background staining. Furthermore, for successful imaging, we emphasize the careful handling of samples and the importance of maintaining a constant high temperature for antigen retrieval.

قبل البدء في تحسين البروتوكول الخاص بنا ، حددنا الخطوات الرئيسية للتلوين الناجح من خلال البحث في PubMed عن الدراسات التي استخدمت أنسجة FFPE للتلطيخ المناعي للشبكات وقارنا بروتوكولاتها. تم تحديد الاختلافات الواعدة في البروتوكول كخطوات رئيسية لتحسين البروتوكول ، في حين لم يتم تغيير الخطوات ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues at JoVE.com

ترتبط مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بأمراض مختلفة ، وغالبا ما يستخدم التألق المناعي لتصورها. ومع ذلك ، هناك العديد من بروتوكولات التلوين ، وفي كثير من الحالات ، يتم فحص نوع واحد فقط من الأنسجة. هنا ، نضع بروتوكولا قابلا للتطبيق بشكل عام لتلطيخ الشبكات في الفئران والأنسجة البشرية.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

من بين اختيار الأجسام المضادة لتصوير الأنسجة ، تشكل عملية التثبيت تحديا من خلال إخفاء الحاتمة. لذلك ، يلزم وجود خطوة مسترد مخصصة لفضح هذه المستضدات لربط الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب التألق الذاتي المتأصل في الأنسجة صعوبات من خلال تلطيخ الخلفية العالية.ومع ذلك ، فإن استخدام مناهج مختلفة في البروتوكولات في الأدبيات يعيق المقارنة الموحدة بين الصور. تهدف دراستنا إلى تلبية الطلب على الإجراءات الموحدة ومساعدة الباحث في التغلب على التحديات أثناء عملية التصوير. أنشأنا بروتوكول تصوير متعدد الاستخدامات ينطبق على الأنسجة المختلفة من خلال مقارنة البروتوكولات المختلفة المختلفة.لذلك يوفر عملنا نصائح إرشادية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من استخدام الأجسام المضادة إلى تركيب العينات ، مع تسليط الضوء على المزالق المحتملة. تعمل النتائج التي توصلنا إليها على تطوير البحث من خلال إدخال جسم مضاد أولي جديد لثلاثة هيسون سيترولين ، وعامل اختزال ذاتي الفلورسنت لتقليل تلطيخ الخلفية. علاوة على ذلك ، من أجل التصوير الناجح ، نؤكد على المعالجة الدقيقة للعينات وأهمية الحفاظ على درجة حرارة عالية ثابتة لاسترجاع المستضد.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

4.1K Views.  University of Hamburg. من بين اختيار الأجسام المضادة لتصوير الأنسجة ، تشكل عملية التثبيت تحديا من خلال إخفاء الحاتمة. لذلك ، يلزم وجود خطوة مسترد مخصصة لفضح هذه المستضدات لربط الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب التألق الذاتي المتأصل في الأنسجة صعوبات من خلال تلطيخ الخلفية العالية.

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تصوير مصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

﻿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples

Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples  

To begin, prepare 10 times concentrated citrate, target retrieval solution or TRS of pH six, according to the manufacturer's instructions. Dilute it to a ratio of 1:10 with deionized water. Then heat the solution in a plastic staining jar to 96 degrees Celsius.Remove the slides from the slide rack and place them into a wet chamber. Next, pipette one or two drops of the autofluorescence-reducing agent onto each tissue sample and incubate the samples for five minutes. Stack the slides back into the slide rack, and rinse for one minute in 60%ethanol using upward and downward motions to remove the unused autofluorescence-reducing reagent.Submerge the slide rack in deionized water for five minutes. Transfer the slides into a staining jar with preheated TRS Buffer for Antigen Retrieval. Incubate the slides for 10 minutes at 96 degrees Celsius in a water bath.Remove the staining jar and let it cool to room temperature for approximately 60 to 90 minutes. Next, remove the TRS while keeping the slides in the jar. Rinse the slides twice with TRIS Buffered Saline containing 0.05%Tween at pH 7.4 for three minutes each to remove any remaining TRS residues.Place the slides in a wet chamber. Gently wipe excess water from the slides using paper tissues, then encircle each sample using a hydrophobic barrier pen to prevent the antibody solution from running off.

حجب التألق الذاتي واسترجاع المستضد في عينات الأنسجة

Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples

Begin by pipetting one drop of ready-to-use blocking solution with donkey serum onto the tissue samples. Then incubate the samples for 30 minutes at room temperature. Remove the excess blocking solution from the slides by tapping the edge against a hard surface.Dilute the primary antibodies in the antibody dilution buffer to prepare 100 microliters of the final solution for each sample. Set up the antibodies, one tube for each primary antibody and one for each isocontrol antibody. Evenly spread 100 microliters of isocontrol antibodies to one sample, and 100 microliters of myeloperoxidase and citrullinated histone H3, or myeloperoxidase and neutrophil elastase antibody dilution to the other sample.Place the slides in a wet chamber and store them overnight at four degrees Celsius. The following day, tap off excess primary antibody solution from the slides and stack them in a cuvette. Rinse the slides three times for five minutes each using Tris buffered saline with tween To remove the remaining primary antibody solution.Prepare two distinctly fluorescent secondary antibodies, donkey anti-goat for myeloperoxidase and donkey anti-rabbit for citrullinated histone H3 staining. Dilute each antibody to 7.5 micrograms per milliliter concentration in the antibody dilution buffer. Place the slides in a wet chamber and dispense 100 microliters of the secondary antibody solution onto each sample.Incubate them for 30 minutes at room temperature protected from light. Remove excess secondary antibody solution by tapping the slides. Put the slides in a slide rack.Submerge the slides three times for five minutes each in a staining jar filled with PBS to wash off unbound antibodies. Prepare the dappy solution and dilute it to a concentration of one microgram per milliliter with deionized water. Submerge the slide rack in a staining jar containing the dappy solution and incubate for five minutes at room temperature in the dark.Next, submerge the slide rack in a staining jar with PBS for five minutes to wash off any excess dappy solution. Finally, mount the samples using cover slips and mounting medium. The citrullinated histone H3 antibody only bound to the extracellular histones and showed no staining of intracellular histones.The human or mouse specific myeloperoxidase antibody showed no specific staining. While the universal human and mouse antibodies showed consistent good staining for myeloperoxidase. When no blocking agent was used, some mouse samples showed more non-specific and partial positive staining.When blocked, the five minutes blocking time showed good results compared to the 10 minutes blocking time. The higher temperatures in the microwave and water bath showed consistently moderate to good antigen retrieval. Whereas in a 60 degrees Celsius water bath there was only partially positive to no staining.For double staining, more favorable results were obtained for the samples incubated at 96 degrees Celsius water bath. However, exceeding the incubation time of 40 minutes at 96 degrees Celsius resulted in less intense antibody staining.