للبدء ، قم بإزالة الأغطية العلوية والسفلية من عمود الدوران في مجموعة إثراء البروتين التجارية واحتفظ بها للاستخدام في المستقبل. ضع عمود الدوران غير المغطى في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الإعداد عند 1000 جرام ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 ثانية لإزالة محلول التخزين والتخلص منه.
أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى حبات التخصيب في عمود الدوران ، واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. بعد الطرد المركزي لعمود الدوران كما هو موضح سابقا ، تخلص من المخزن المؤقت الذي تم جمعه. استبدل الغطاء السفلي وأضف 200 ميكرولتر من الماء إلى عمود الدوران قبل استبدال الغطاء العلوي.
امزج ملاط الخرزة المائية المحضر عن طريق سحبه لأعلى ولأسفل قبل نقل 40 ميكرولترا منه إلى عينة منتج دواء الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعدة مسبقا. احتضان الأنبوب عن طريق تدويره في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بعمل ثقوب في فريت مناسب الحجم باستخدام إبرة قياس 16 وأدخلها في طرف طرف 200 ميكرولتر.
انقل العينة بالخرز إلى الطرف المحضر وضعها في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 ملليلتر مع وجود ثقب في الغطاء العلوي. أجهزة الطرد المركزي الطرف في الأنبوب لإزالة الحل. اغسل الخرز بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى الحافة.
قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل عن طريق الطرد المركزي للطرف في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 ملليلتر. بعد ذلك ، اغسل الخرزات في الطرف ب 200 ميكرولتر من الماء وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا لإزالة الماء. الآن ، أضف 10 ميكرولتر من محلول الشطف إلى الحافة وانقع الخرزات فيه جيدا عن طريق سحب الملاط لأعلى ولأسفل 10 مرات.
انقل الطرف إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 0.5 ملليلتر مع وجود ثقب في الغطاء العلوي وأجهزة الطرد المركزي للأنبوب لجمع البروتين المستعصي. أضف 1.5 ميكرولتر من محلول التربسين إلى المحلول واتركه يهضم طوال الليل عند 28 درجة. ثم أضف 1.5 ميكرولتر من 25 ملليغرام لكل ملليلتر من ديثيوثريتول إلى العينة واحتضانها عند 90 درجة لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، احتضان العينة مع 1.5 ميكرولتر من 0.25 مولار يودواسيتاميد في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 3.5 ميكرولتر من 10٪ حمض ثلاثي كلورو الخليك أو TFA ودوامة العينة لمدة دقيقتين. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 14،400 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب SDC و SLS.
جمع طاف محمض لتحلية. أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت B إلى طرف تحلية GC. ثم ضع الطرف في حامل وطرده عند 1000 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
أضف 50 ميكرولترا من Buffer A إلى الطرف وقم بتدوير الطرف كما هو موضح سابقا. والآن، أضف العينة المحمضة إلى الطرف. أجهزة الطرد المركزي الطرف في حامل في 500 غرام لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، اغسل الطرف بإضافة 50 ميكرولترا من Buffer A إليه وتدويره عند 500 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الببتيد من طرف تحلية GC بإضافة 50 ميكرولترا من Buffer B والطرد المركزي للطرف في أنبوب جديد عند 500 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتجفيف المحلول الذي تم جمعه باستخدام مكثف فراغ.
أعد تعليق المحلول المجفف في 30 ميكرولتر من محلول حمض الفورميك 0.1٪. قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لمخاليط الببتيد عند 214 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. أخيرا ، انقل 10 ميكرولتر من العينة المهضومة إلى قنينة عينة كروماتوغرافية سائلة وقم بتحليل ميكروغرام واحد من العينة باستخدام nano LC-MS / MS.
كشفت ملامح الكروماتوجرام الأيوني الكلي لبروتينات الخلية المضيفة أنه بالمقارنة مع الهضم المباشر ، فإن معظم ببتيدات الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الرئيسية إما تم تقليلها أو التخلص منها بعد إثراء البروتين الموضح إلى جانب بروتوكول الهضم المحدود.
