من وعاء المفاعل الحيوي للخزان المقلوب ، أوقف درجة الحموضة في درجة الحرارة والتحكم في DO على وحدة تحكم المفاعل الحيوي مؤقتا وقم بتوزيع جميع PBS بالكامل من الوعاء إلى زجاجة النفايات. قم باللحام بوحدة الترشيح ذات الاستخدام الفردي إلى منفذ على حقيبة التخزين ذات الاستخدام الواحد سعة 10 لتر. قم بتصفية ونقل وسيط MSC الكامل الخالي من المصل إلى حقيبة التخزين.
اضبط المضخة بسرعة واحدة على 300 دورة في الدقيقة. والاستغناء عن لتر واحد من الوسط من كيس التغذية في الوعاء. أوقف المضخة.
وابدأ درجة الحموضة في درجة الحرارة وحلها إلى DO مرة أخرى ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أغلق وافصل الأنبوب الذي يربط التغذية المرتدة بأنبوب التغذية. قم بلحام الأنبوب من زجاجة الناقلات الصغيرة المشتتة إلى أنبوب التغذية.
وضخ جميع المحتويات من الزجاجة في الوعاء. بعد ذلك ، أعد التعليق 2.5 مرة 10 إلى HMCs الثمانية في وسط خال من المصل ونقلها إلى الزجاجة الفارغة التي كانت تحتوي سابقا على تعليق الناقل الصغير. أضف متوسط خال من المصل إلى 500 ملليلتر في المجموع داخل الزجاجة واخلط تعليق الخلية.
ضخ جميع المحتويات من الزجاجة في الوعاء. أغلق وافصل الأنبوب الذي يربط الزجاجة بأنبوب التغذية ثم قم بلحام كيس التغذية مرة أخرى. اضبط إعدادات التحريض على وحدة التحكم لبدء تلقيح الخلايا للناقلات الدقيقة.
وإنشاء نظام آلي للملحق والتبادل الوسيط. قم بلحام أكياس أخذ العينات التي تستخدم لمرة واحدة في أنبوب أخذ العينات. وجمع العينات في النقاط الزمنية المطلوبة.
في وقت حصاد الخلية على وحدة التحكم ، اضبط سرعة التحريض على الصفر حتى تستقر الناقلات الصغيرة. والاستغناء عن طاف في نظام التغذية ، وترك ما يقرب من لتر واحد من تعليق الثقافة في الوعاء. قم بلحام الكيس الذي يحتوي على 50 مل من محلول الهضم الطازج إلى 500 مل من HBSS للتخفيف.
وضخ كل المحلول في الوعاء ، عبر أنبوب التغذية. اضبط سرعة التحريض بين 40 إلى 45 دورة في الدقيقة لإذابة الناقلات الدقيقة. بعد أن تذوب الناقلات الصغيرة في غضون 40 إلى 60 دقيقة ، قم بلحام كيس التخزين سعة ثلاثة لترات القابل للتصرف في أنبوب الحصاد وضخ تعليق الخلية بالكامل.
قم بتشغيل نظام معالجة الخلايا أثناء حصاد الخلايا. وقم بتثبيت مجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة على الجهاز ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لحام أكياس تعليق الخلية ، وغسل العازلة والثقافة المتوسطة إلى المجموعة.
أدخل المعلمات التشغيلية وابدأ عملية الغسيل وإعادة التعليق الآلية. جمع عينة من الخلايا من غرفة الطرد المركزي كما هو موضح في أنظمة معالجة الخلايا لحساب كثافة الخلية. بعد العد ، أعد ضبط كثافة الخلية إلى مرتين في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر ، باستخدام الوسط الكامل الخالي من المصل.
لعملية تكوين الخلية في مفاعل حيوي سعة 15 لترا ، استخدم محلول التركيبة لإعادة تعليق الخلايا المحصودة. لحام 250 ملليلتر من الخلايا المعاد تعليقها لملء الخلية. قم بتجميع العبوة التي تستخدم لمرة واحدة وإنهاء المجموعة الاستهلاكية على نظام تعبئة الخلايا.
وقم بتشغيل نظام التبريد المسبق ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة قبل إعادة تعليق الخلايا. اتبع التعليمات الموجودة على النظام واضبطه لملء 30 ملليلتر لكل كيس بإجمالي 20 كيسا لكل مجموعة. قم بلحام المجموعة الجديدة المكونة من 20 كيسا للحفظ بالتبريد في مجموعة التعبئة الاستهلاكية التي تستخدم لمرة واحدة وكرر التعبئة والانتهاء حتى يتم اقتباس جميع الخلايا.
بالنسبة ل hMSCs ، تم تحقيق توسع تراكمي بمقدار 128 ضعفا مع بقاء الخلية فوق 90٪ أظهر تناول الجلوكوز علاقة سلبية مع توسع الخلايا ، مما يدل على التمثيل الغذائي المرتبط بنمو الخلايا السليم. تحتفظ MSCs التي تم حصادها حديثا بعلامات النمط الظاهري الكلاسيكية مع أكثر من 95٪ تعبير للعلامات الإيجابية وأقل من 2٪ للعلامات السلبية. أظهرت الخلايا المحفوظة بالتبريد التصاق جيد وسلوك تمدد طبيعي وشكل مغزل نموذجي مع نمو حلزوني بعد الذوبان وإعادة الطلاء إلى قوارير 2D.
علاوة على ذلك ، حافظت الخلايا أيضا على قدرتها على التمايز إلى سلالات عظمية المنشأ وأديبوجينية وغضروفية المنشأ. يمكن اعتماد هذه المنصة لزراعة خلايا أخرى تعتمد على المرساة أيضا ، مثل خلايا HEK293T و Vero. بعد عملية نقل B2B في المفاعل الحيوي سعة 15 لترا ، وصلت الخلايا HEK293T إلى ذروة تركيز الخلايا 1.68 مرة 10 من الخلايا السبع لكل ملليلتر.
بينما وصلت خلايا فيرو إلى تركيز 1.08 في 10 إلى الخلايا السبع. حافظ كلا النوعين من الخلايا على قابلية عالية للحياة.
