Human iPSC-Derived mDA Neurons Seeding and Compound Treatment for Phenotypic Profiling

للبدء ، خذ لوحة Poly-D-Lysine المطلية مسبقا المكونة من 384 بئرا والتي تحتوي على 25 ميكرولترا من اللامينين لكل بئر من الثلاجة وقم بموازنة اللوحة مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا تحت غطاء زراعة الخلايا. قبل البذر مباشرة ، قم بشفط 15 ميكرولترا من محلول الطلاء من كل بئر باستخدام معالج سائل آلي أو ماصة ذات 16 قناة. ثم قم بتوزيع 50 ميكرولترا من محلول الخلية الذي يحتوي على 300،000 خلية عصبية لكل مليلتر في كل بئر.

تجنب تعبئة الخلايا في الأعمدة 1 و2 و23 و24 والصفوف A وB وO وP لتقليل تأثيرات الحواف المحتملة. املأ تلك الآبار غير المستخدمة ب 80 ميكرولترا من المياه المالحة المخزنة بالفوسفات. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

سخن حجما مناسبا من وسط الصيانة الكاملة في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء. تحضير محلول مركب مركز 1.5 مرة لجميع التركيزات المطلوبة المراد اختبارها ، باستخدام وسط صيانة كامل للتخفيفات. باستخدام نظام سحب تلقائي ، تخلص من 40 ميكرولترا من الوسط لكل بئر من اللوحة المحتوية على الخلايا العصبية ، تاركا 20 ميكرولترا من الوسط لكل بئر.

ثم أضف 40 ميكرولترا من المحلول المركب المركز 1.5 مرة لكل بئر لتحقيق التركيز النهائي المطلوب. باتباع البروتوكول المطلوب ، تم زراعة الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط الحاملة للطفرة في الدماغ المتوسط بنجاح لمدة ستة أيام ، وعولجت إما بثنائي ميثيل سلفوكسيد أو مثبط كيناز LRRK2. كانت الخلايا العصبية ملطخة بالبقع النووية والأجسام المضادة ضد ألفا سينوكلين وهيدروكسيلاز التيروزين و MAP2.