Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) Assay for Evaluating ROS Production

ابدأ بإذابة 0.0005 جرام من NBT في 10 ميكرولتر من DMSO. بعد الدوامة لمدة 15 دقيقة ، أضف 90 ميكرولترا من محلول الملح المتوازن من هانك أو HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم وميكرولتر واحد من مواد الاختبار. مرة أخرى ، دوامة الأنبوب لمدة تصل إلى دقيقتين.

لإجراء اختبار شريحة NBT ، قم بخلط ونقل ميكرولتر من العدلات متعددة الأشكال المنشطة مسبقا إلى شريحة زجاجية نظيفة. احتضان الشريحة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من محلول عمل NBT فوق الخلايا.

احتضان مرة أخرى لمدة 20 دقيقة ، وحماية من الضوء. بعد تجفيف الشريحة ، قم بإصلاحها عن طريق وضع قطرة من الميثانول في كل بئر لمدة دقيقة واحدة. تلطيخ الشريحة مع 0.03 سافرانين لمدة دقيقة واحدة إضافية.

في كل بئر ، عد 100 خلية عشوائية ، والتمييز بين العدلات مع وبدون رواسب الفورمازان. لإجراء مقايسة القياس الطيفي NBT ، قم بخلط ونقل 90 ميكرولترا من العدلات متعددة الأشكال النووية المنشطة مسبقا إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. ثم أضف بعناية 20 ميكرولترا من محلول NBT ستة مليمولار واحتضان الأنبوب في الظلام لمدة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من 10٪ SDS ودوامة. Sonicate مع صوتنة طرف بسعة 60٪ ، مضيفا خمس دورات مدة كل منها 15 ثانية وفواصل زمنية مدتها 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 12،000g لمدة خمس دقائق.

انقل 60 ميكرولترا من المادة الطافية إلى صفيحة صافية ذات 96 بئرا وقم بقياس امتصاص المنتج الطافي عند 570 نانومتر. أشارت نتائج الفحص الطيفي إلى أن 100 نانومول PMA تسبب في ارتفاع إنتاج ROS مقارنة بمجموعات fMLP ومجموعات التحكم. أكدت نتائج اختبار شرائح NBT نتائج القياس الطيفي ، حيث أظهرت PMA باعتباره التحفيز الأكثر كثافة لإنتاج ROS مقارنة ب fMLP.