ابدأ باستخراج الحمض النووي الجينومي من أوراق الخيزران من النوع البري والمصاب بالبكتيريا الزراعية. تضخيم الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على الموقع المستهدف للجينات المستهدفة من أوراق الخيزران من النوع البري والبكتيريا الزراعية المصابة باستخدام شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء هضم إنزيم النوكلياز الداخلي عن طريق تحضير خليط تفاعل يحتوي على ميكرولتر واحد من العمر -1 ، وميكروغرام واحد من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ومخزن مؤقت خمسة ميكرولتر 10X.
ثم أضف الماء إلى الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر. احتضان خليط الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. باستخدام هلام الكهربائي ، وتحليل نسبة شظايا الحمض النووي هضمها.
قارن الشظايا المهضومة من العينات البرية والمصابة بالبكتيريا الزراعية لتقييم كفاءة تحرير الجينات. تعريض شتلات الخيزران لظروف شدة الضوء العالية لزيادة كمية الضوء الممتص وتفعيل نظام الحماية الضوئية للأوراق. بعد ذلك ، قم بتشغيل مقياس الفلور IMAGING-PAM واضبط شدة الضوء الأكتيني لقياس مضان الكلوروفيل في النظام الضوئي الثاني لأوراق الخيزران.
يشير لون حارة بيتا الأحمر الناتج عن جين RUBY إلى نجاح التعبير الجيني بوساطة Agrobacterium في أوراق الخيزران. من بين سلالات Agrobacterium الأربعة ، تسببت سلالة GV3101 في تراكم حارة بيتا الأكثر أهمية في أوراق الخيزران المصابة. بعد الإصابة بتركيبات CRISPR-Cas9 ومعالجات الإضاءة العالية ، أظهرت مناطق معينة من شفرات الأوراق قيم تبريد غير كيميائية ضوئية أقل.
علاوة على ذلك ، أكد هضم الإنزيم وتحليل التسلسل الطفرة الناجحة لجين PeVDE في المناطق المحررة. أظهرت نتائج تسلسل سانجر لجزء PeVDE بعد التحرير بواسطة كل من sgRNA1 و sgRNA2 حذف جزء طويل في جين PeVDE. بعد 30 يوما من الإصابة بالبكتيريا الزراعية ، أظهرت مناطق الأوراق المنقولة ب sgRNAs لكل من PeVDE و PeCCR5 قيم تبريد غير كيميائية ضوئية أقل.
