Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

لبدء بذر الخلايا ، عد الخلايا بعد فصلها باستخدام الطرق الميكانيكية أو الأنزيمية. باستخدام ماصة صغيرة ، أضف العدد المحسوب للخلايا لكل بئر في لوحة الآبار الستة التي تحتوي على شبكات مجهر إلكتروني معدة مسبقا مع تجنب الفقاعات. تأكد من الحفاظ على 1.5 إلى 2.0 ملليلتر من تعليق الخلية لكل بئر.

لنقل المستنسخة الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية ، احتضان الخلايا لمدة 16 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل وميكروغرام واحد من الحمض النووي إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف. لكل منها ، قم بتخفيف ثلاثة ميكرولترات من كاشف النقل في DMEM الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف منفصل.

تجانس الخليط بشكل منفصل باستخدام ماصة صغيرة. ثم أضف خليط كاشف النقل إلى خليط الحمض النووي عبر ماصة دقيقة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف النقل ويسقط خليط الحمض النووي الحكيم في كل بئر مباشرة أعلى الشبكات.

استبدل وسط النمو بعد 16 إلى 24 ساعة من النقل. بعد 24 ساعة من مرحلة النقل المشترك ، أحب الفحص المجهري والفلورسنت مثل الفحص المجهري ، وأظهر أن جميع الشبكات لديها الحد الأدنى من التمزق في طبقة الكربون. احتوت الخلايا الموجودة على كل من الشبكات الوهمية والشبكات المنقولة بشكل مشترك على خلايا قابلة للحياة في مربعات شبكية متعددة.