قبل الغطس في تجميد شبكات المجهر الإلكتروني التي تحتوي على الخلايا ، افحص الشبكات تحت المجهر البصري المقلوب. سجل كثافات الخلايا على كل شبكة لضبط أوقات النشاف أثناء تجميد الغطس. قم بتسخين ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS في طبق فارغ عند 37 درجة مئوية.
لإعداد fiducials الذهب ، ماصة 50 ميكرولتر من محلول حبة الذهب الغروية 10 نانومتر في أنبوب نظيف 1.5 ملليلتر. أضف 2 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار إليه وقم بتجانسه عن طريق السحب الدقيق بشكل متكرر. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 15،000 إلى 20،000 غرام لمدة 15 دقيقة.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات باستخدام ماصة صغيرة. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولترا من PBS وطرد الأنبوب مرة أخرى ، كما هو موضح سابقا. نضح أربعة ميكرولتر من الحبيبات باستخدام طرف 10 ميكرولتر ونقله إلى أنبوب نظيف 1.5 ملليلتر.
قم بإعداد الغرفة البيئية بنسبة 95٪ رطوبة و 30 درجة مئوية. باستخدام ملاقط خمسة × 15 ، حدد شبكة واغسلها باستخدام PBS. نقل الشبكة المغسولة إلى ملاقط الغرق.
بمجرد تأمين الشبكة ، قم بإزالة الملقط خمسة × 15 وحرك المشبك على الملقط الغاطس. أدخل الشبكة في الفريزر المكبس مع الحفاظ على المشبك آمنا. أضف ميكرولتر واحد من fiducials الذهب إلى الجانب الخلفي من الشبكة.
ثم أضف اثنين إلى ثلاثة ميكرولتر من PBS إلى جانب الكربون من الشبكة. استخدم النشاف الآلي لمسح الجزء الخلفي من الشبكة قبل الغطس في التجميد في الإيثان السائل. كشفت صورة المجهر الإلكتروني والضوء المترابط بالتبريد لخلايا U2OS المنقولة عن وجود خلايا منتجة لفيروس نقص المناعة البشرية.
أظهرت صورة التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني جزيئات متعددة من فيروس نقص المناعة البشرية تتبرعم من غشاء البلازما لخلايا U2OS.
