للبدء ، رش الماوس القتل الرحيم بنسبة 75٪كحول. ثم قمت بتعقيم مقص التشريح لفتح الجلد وفضح تجويف الصدر. اقطع الحجاب الحاجز ، ثم استمر في القطع لأعلى باتجاه الفك السفلي وقم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون التي تعرض الشريان السباتي بعناية.
بعد ذلك ، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي لجعل الدم يتدفق من الدورة الدموية المغلقة. باستخدام حقنة حقن ببطء 20 ملليلتر من محلول التروية المبردة مسبقا في البطين الأيسر. ضع الماوس تحت المجهر المجسم.
ثم باستخدام مقص تشريح دقيق ، انزع الدهون والأنسجة الضامة حول الشريان السباتي. عزل الشريان السباتي وغسله مع برنامج تلفزيوني لطرد أي دم متبقي. نقل الشريان إلى صفيحة ستة آبار تحتوي على 1.5٪ FBS على الجليد.
باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بتشريح الشريان السباتي طوليا ووضعه بشكل مسطح في صفيحة جديدة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر واحد من FBS على الجليد. اغسل بطانة الشريان بعناية باستخدام FBS لإزالة الدم المتبقي. قطع الشريان إلى قطعتين من الأنسجة المربعة ملليمتر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإغراق الأنسجة في القاع. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 500 ميكرولتر من كاشف التفكك أ- ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع ماصة واحدة برفق باستخدام ماصة ملليلتر واحدة كل 10 دقائق. ثم أضف 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في الأنبوب واخلطه جيدا.
قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرون في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم قم بطرد الراشح وإزالة المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من كاشف التفكك ب- ضع الأنبوب في حمام مائي لفصل الخلايا تماما إلى تعليق خلية واحدة. بعد خمس دقائق ، أضف 200 ميكرولتر من 5٪ FBS لإنهاء تفاعل الهضم ، والطرد المركزي للتعليق ، وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS على الجليد.
أظهرت الملاحظات المجهرية أن الجمع بين كاشف التفكك B والكاشف A أدى إلى تفكك أكثر شمولا لأنسجة الشريان السباتي مقارنة باستخدام كاشف التفكك A وحده. تم جمع ما مجموعه 176،000 خلية مفردة من تسعة سباتي يسار مع فصل معظم الأوعية الدموية بنجاح إلى خلايا مفردة ذات قدرة عالية على البقاء. بعد عملية الهضم غير الخاضعة للإشراف ، كشف التجمع القائم على SIRAH عن أربعة أنواع رئيسية من الخلايا في الشرايين السباتية الطبيعية للفئران.
