ابدأ بسحب 0.5 ملليلتر من ثقافة المرحلة اللوغاريتمية للشلوريلا الشائعة. انشر الثقافة في طبق تريس أسيتات فوسفات أو طبق أجار تاب. تنمو الثقافة لمدة خمسة أيام عند 25 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بتلقيح 10 ملليلتر من مرق LB المكمل بحلقة مليئة بثقافة agrobacterium tumefaciens بالكهرباء في قارورة شاكر. احتضان القارورة عند 28 إلى 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتلقيح ملليلتر واحد من الثقافة الليلية إلى 50 ملليلتر من LB المكملة. احتضان القارورة عند 28 إلى 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
للمشاركة في زراعة الطحالب والثقافات البكتيرية. أولا ، نقل ثقافة agrobacterium إلى أنبوب 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 4،000 جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بإخراج المادة الطافية للتخلص منها وغسل الخلايا مرتين باستخدام وسيط الحث. بعد ذلك ، أضف 25 ملليلترا من وسائط الحث على لوحة ثقافة Chlorella Vulgaris. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر ، ثم أجهزة الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من المادة الطافية ، ادمج حبيبات خلايا الطحالب مع 200 ميكرولتر من التعليق البكتيري. هز الثقافة مجتمعة في حاضنة دوارة عند 21 إلى 25 درجة مئوية ، وقال في 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. انشر 200 ميكرولتر من الثقافة المختلطة على ألواح متوسطة الحث ، مكملة ب 15 ملليمول من الجلوكوز واحتضان الألواح في الظلام عند 21 إلى 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
بعد ثلاثة أيام ، اجمع الطحالب الدقيقة في قارورة باستخدام 10 ملليلتر من وسائط TAP. تستكمل مع 20 ملليغرام لكل لتر من التتراسيكلين. احتضان القارورة في الظلام لمدة يومين ، والحفاظ على درجة حرارة تتراوح بين 21 إلى 25 درجة مئوية.
لوحة 500 ميكرولتر من الثقافة على وسائط انتقائية تستكمل مع 20 ملليغرام لكل لتر من التتراسيكلين. احتضان الألواح عند 21 إلى 25 درجة مئوية في الظلام لمدة يومين ، قبل تحويلها إلى غرفة مضيئة. حدد مستعمرات مفردة من لوحة التحويل وقم بخطها على ألواح أجار TAP.
لإجراء مستعمرة PCR ، ابدأ بإضافة كمية صغيرة من خلايا الطحالب المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم. غلي المحلول عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وبالمثل ، قم بمعالجة قالب PCR آخر لتأكيد غياب البكتيريا الزراعية في العينة.
قم بتشغيل عينات PCR على هلام أغاروز الحمض النووي مع سلم ، للتحقق من حجم الشظايا الناتجة. كانت المستعمرات المحولة قادرة على النمو على لوحات تحتوي على الهيجروميسين مع سيفوتاكسيم. لم تنمو مستعمرات النوع البري على اللوحات.
تم الحصول على مستعمرات مقاومة تصل إلى 70 ملليغرام لكل لتر من سيفوتاكسيم. مستعمرة PCR Amplicon من pCAMBIA1302 كان غائبا في عينات الطحالب. ومع ذلك ، تم اكتشاف MGFP5G في amplicon في جميع عينات الطحالب الثلاثة.
أظهرت ثقافات الطحالب التي كانت بشكل متكرر ثقافات فرعية من سيفوتاكسيم غياب بروتين الفوعة E2 ، مما يدل على غياب البلازميد. لوحظ اختلاف كبير في نمو الطحالب للمحولات والسلالات البرية. على الرغم من انخفاض النمو ، كان للمحول مستويات مضان أعلى عند تطبيعه لكثافة الخلية.
