In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

للبدء ، شطف الغرفة العلوية من 24 لوحة بئر مع برنامج تلفزيوني. امزج خلايا BEND3 مع وسط DMEM باستخدام خلاط دوامة لعمل تعليق. بعد ذلك ، قم بزرع 200 ميكرولتر من تعليق خلية BEND3 على غشاء PET في الغرفة العلوية للوحة 24 بئر.

أضف 1،200 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الغرفة السفلية للوحة لتثبيت الضغط الاسموزي للغرف العلوية والسفلية. قم بتغيير الوسط عن طريق إزالة الوسط القديم ببطء من جانب واحد باستخدام ماصة الضغط السلبي وإضافة وسيط جديد على طول الجدار أثناء تبادل السوائل. قبل قياس TEER ، ضع المقاوم ، محلول هيبوكلوريت الصوديوم 5٪ ، 75٪ إيثانول ، وماء مقطر مزدوج على طاولة فائقة التنظيف.

قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة للقضاء على البكتيريا المتبقية ومسببات الأمراض. ضع الأقطاب الكهربائية في محلول هيبوكلوريت الصوديوم 5٪ مع الاهتزاز البطيء لمدة ثلاث إلى خمس ثوان. ثم تزج في 75 ٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة.

أخيرا ، انقله إلى PBS أو الماء المقطر المزدوج حتى الاستخدام. بعد ذلك ، قم بتشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من مقياس مقاومة الخلية. انقر فوق تحديد لوحة وحدد 24 لوحة بئر.

وفقا للعملية ، حدد تسلسل الكشف المناسب. أدخل مقاوما كيلو أوم في القابس الأيمن لمعايرة الجهاز. إذا كانت نتيجة المعايرة 1000 زائد ناقص 5 أوم ، فاعتبر الجهاز دقيقا.

إذا لم يكن كذلك ، فانقر فوق وحدات الوضع على الواجهة الرئيسية لتحديد أوم ثم انقر فوق معايرة. ثم قم بإزالة المقاوم كيلو أوم واستبدله بقطب القياس باستخدام سلك توصيل. ضع القطب عموديا في لوحة البئر 24 التي تحتوي على وسيط فقط وانقر فوق معالجة فارغة على الجهاز.

يجب أن تكون قيمة الخلفية لمقاومة اللوحة بدون خلايا جالسة حوالي 134.4 أوم. بعد ذلك ، أدخل القطبين في الغرفتين العلوية والسفلية للوحة الجلوس ، بحيث تكون طبقة الخلية بينهما. سجل قيمة المقاومة عن طريق الضغط برفق على الدواسة.

تأكد من أن القطب لا يلمس الخلايا الموجودة في الغرفة العلوية وأسفل الغرفة السفلية. احصل على قيم TEER بضرب قيم المقاومة الكهربائية في المساحة السفلية للغرفة العلوية ، كما هو موضح في المعادلة. ارسم مخططا خطيا ل TEER مقابل الوقت بالأيام.

عندما لا تزداد قيمة المقاومة بمرور الوقت ، تكون الخلايا قد شكلت حاجزا. أظهرت قيم المقاومة المرسومة مقابل الوقت لخلايا BEND3 أن قيم TEER للخلية بدأت في الاستقرار في اليوم الخامس.