للبدء ، خذ عينة الحويصلة المجففة خارج الخلية التي تم الحصول عليها من البول البشري باستخدام نهج مصيدة EV. قم بإعداد مخزن مؤقت جديد للتحلل مع المكونات الموضحة. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل لإذابة عينة EV المجففة.
سخني العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع الرج عند 1،100 دورة في الدقيقة. بعد تبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيفها خمسة أضعاف بإضافة 400 ميكرولتر من 50 مللي مولار تياب. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
أضف مزيج التربسين والليسين C إلى العينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج عند 1،100 دورة في الدقيقة. ثم أضف 50 ميكرولترا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 10٪ أو TFA لتحمض العينة. علاوة على ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل إلى العينات ودوامة الخليط لمدة دقيقتين.
أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة ثلاث دقائق عند 20،000 G وإزالة الطبقة العليا بعناية دون إزعاج الواجهة. تجفيف المرحلة المائية باستخدام مكثف الطرد المركزي فراغ. الآن أعد تعليق العينة المجففة في 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لتحمض الببتيدات.
لتحلية العينة ، استخدم طرف تحلية CA18 وقم بتكييفها ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA و 80٪ أسيتونيتريل ، متبوعا بغسلتين ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتحميل عينة الببتيد المحمضة في الحافة واغسلها ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتحضير الببتيدات ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA و 80٪ أسيتونيتريل.
بعد سحب المحلول كما هو موضح ، أعد تعليق العينة المجففة إلى الفوسفوبروتيوميكس في 200 ميكرولتر من مخزن التحميل لإثراء الفوسفوببتيد. أضف 50 ميكرولترا من الخرز إلى العينة واهتز بقوة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل العينة بالخرز في الطرف المكسور وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 100 جم ، واغسل الطرف على التوالي باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، وغسل المخازن المؤقتة واحد واثنين.
ضع الطرف مع الخرز في أنبوب جديد لجمع الببتيدات الفوسفوببتيدات المستعصية. أضف 50 ميكرولترا من محلول الشطف إلى الطرف وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 20 جم ، ثم جفف الببتيدات الفوسفوببتيدات المستعصية باستخدام مكثف طرد مركزي فراغي.
