High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format

باستخدام ماصة مصلية ، ضع بعناية أربعة ملليلتر من الدم البشري الهيبارين على ثمانية ملليلتر من وسط تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الدم في 550G لمدة 30 إلى 50 دقيقة عند 20 درجة مئوية. ثم استخدم ماصة ملليلتر واحد لإزالة الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والخلايا أحادية النواة.

اجمع العدلات من النطاق الغائم السفلي وحوالي ثلاثة إلى أربعة ملليلتر تحت السائل الصافي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من PBS. اقلب الأنبوب برفق مرتين إلى ثلاث مرات لخلط تعليق العدلات. أجهزة الطرد المركزي تعليق العدلات عند 400G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية ، ثم صب بعناية المادة الطافية من الأنبوب وإعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS.

مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، استخدم الشفط الفراغي للتخلص من الطافات المتبقية على جدار الأنبوب وحول فم الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط العدلات.

اجمع بين ملليلتر واحد من 1.2 ميكروغرام لكل محلول أجسام مضادة ملليلتر مع 0.2 ملليلتر من وسط العدلات في أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف 25 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة إلى آبار التحكم السلبي في لوحة بئر 384. في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، اجمع بين تسعة ملليلتر من محلول الأجسام المضادة ، و 21.6 ميكرولتر من محلول FMLP ، و 1.7784 ملليلتر من وسط العدلات.

أضف 25 ميكرولترا من هذا الخليط إلى آبار التحكم الإيجابية والاختبار في صفيحة بئر 384. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل خمسة ميكرولترات من المحلول المركب من لوحة المكتبة المركبة إلى لوحة البئر 384. أجهزة الطرد المركزي التعليق في 500G لمدة دقيقة واحدة.

أضف 20 ميكرولترا من تعليق العدلات إلى كل بئر باستخدام ماصة 16 قناة. احتضان اللوحة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ثم لإصلاح الخلايا ، أضف ثلاثة ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر ، واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.