نشكر الدكتور إيفان جيليسون والسيدة لي تشو في قلب قياس التدفق الخلوي في UConn Health لمساعدتهم في قياس التدفق الخلوي ، والدكتورة لين بودينجتون في قسم المناعة في UConn Health لدعمها للأدوات ، والسيدة Slawa Gajewska والدكتور Paul Appleton في جوهر البحث السريري في UConn Health لمساعدتهم في الحصول على عينات الدم. نحن نقدر الدكتور كريستوفر "كيت" بونين والدكتورة جنيف هارجيس من كلية الطب بجامعة كاليفورنيا لمساعدتهما في الكتابة العلمية وتحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا البحث بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01HL145454) ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (P20GM121176) ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وجائزة التطوير الوظيفي من جمعية القلب الأمريكية (18CDA34110426) ، وصندوق بدء التشغيل من UConn Health. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

تم الحصول على عينات الدم الكامل الهيبارين من متبرعين أصحاء غير محددين بعد الحصول على موافقة مستنيرة ، على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية ل UConn Health ، وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي. وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الجهات المانحة. تم تطوير معايير الإدراج / الاستبعاد لهذه الدراسة بعناية لضمان ملاءمة المشاركين وتقليل المخاطر المحتملة. وتتراوح أعمار المشاركين المؤهلين بين 18 و 65 عاما، من أي عرق، ويجيدون اللغة الإنجليزية، وقادرون على تقديم موافقة مستنيرة. شمل المشاركون المستبعدون أولئك غير القادرين على تقديم موافقة مستنيرة لأنفسهم ، مثل أولئك الذين يحتاجون إلى ممثل مفوض قانونا ، والأفراد الذين تقل أعمارهم عن 18 عاما أو أكثر من 65 عاما ، والأفراد المسجونين ، والنساء الحوامل. بالإضافة إلى ذلك ، كان على المشاركين أن يكونوا خاليين من استخدام الأدوية المضادة للالتهابات والحالات الالتهابية. كانت العدوى الحالية أو الحالات الالتهابية المزمنة أو الحادة المستمرة أيضا معايير استبعاد. أخيرا ، كان الأفراد الذين لديهم تاريخ حالي أو حديث من عدوى COVID-19 غير مؤهلين للدراسة. تم تصميم هذه المعايير لضمان سلامة المشاركين وملاءمتهم مع تقليل العوامل المربكة المحتملة التي يمكن أن تؤثر على نتائج الدراسة.
1. إعداد الكواشف
<ol><li>وسط العدلات: قم بإعداد وسط العدلات بإضافة 2٪ من ألبومين المصل البشري إلى RPMI-1640 بدون الفينول الأحمر (انظر جدول المواد).</li>
	<li>محلول fMLP: قم بإعداد محلول fMLP عن طريق تخفيفه 100 مرة من محلول تخزين 10 mM fMLP dimethyl sulfoxide (DMSO) (انظر جدول المواد) باستخدام RPMI 1640 بدون الفينول الأحمر ، مما ينتج عنه محلول fMLP 100 ميكرومتر.</li>
	<li>محلول الأجسام المضادة: تمييع 120 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة المترافق mAb24 (mAb24-APC) (انظر جدول المواد) ، والذي يبلغ عن التشكل عالي التقارب ل β2 integrin ، في 10 مل من وسط العدلات ، مما يخلق محلول mAb24-APC 1.2 ميكروغرام / مل mAb24-APC.</li>
	<li>المكتبة المركبة: قم بتخفيف المكتبة المركبة الأولية بتركيز 10 mM إلى 1 mM عن طريق إضافة 5 μL من مكتبة 10 mM (انظر جدول المواد) إلى 45 μL من DMSO في ألواح 384 بئر باستخدام معالج السائل. بعد ذلك ، قم بنقل 5 ميكرولتر لكل بئر من المكتبة المركبة 1 مللي متر إلى لوحة فارغة من 384 بئرا باستخدام معالج السائل.</li>
	<li>كما هو موضح في الشكل 1 ، احتوت أربعة أعمدة ( 1 ، 2 ، 23 ، 24) على DMSO فقط ولكن لا تحتوي على مركبات ، تعمل كعناصر تحكم إيجابية وسلبية في الفحص. قم بتخفيف كل بئر بإضافة 45 ميكرولتر من RPMI-1640 بدون الفينول الأحمر ، مما ينتج عنه تركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر لجميع المركبات.</li>
</ol>2. عزل العدلات من دم الإنسان
<ol><li>باستخدام ماصة مصلية ، ضع بعناية طبقة 4 مل من الدم على 8 مل من وسط تدرج الكثافة المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل (الشكل 2 أ).</li>
	<li>جهاز طرد مركزي الدم عند 550 × جم لمدة 30-50 دقيقة عند 20 درجة مئوية. إبطاء الدوار تدريجيا (عامل التباطؤ 1). ملاحظة: قد يختلف الفصل الناجح للعدلات (النطاق 2 في الشكل 2B) من خلايا الدم الحمراء بين المتبرعين. بالنسبة لمعظم الجهات المانحة ، يكفي الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض المانحين ، قد تكون هناك حاجة إلى 10-30 دقيقة إضافية من الطرد المركزي إذا لم ينجح الفصل (الشكل 2C).</li>
	<li>قم بإزالة البلازما بعناية (السائل الأصفر في الأعلى) والخلايا أحادية النواة (الشريط الغائم العلوي ؛ شريط PBMC في الشكل 2B) باستخدام ماصة 1 مل.</li>
	<li>اجمع العدلات من النطاق الغائم السفلي (شريط العدلات في الشكل 2 ب) وحوالي 3-4 مل تحت السائل الصافي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). امزج تعليق العدلات برفق عن طريق قلبه 2-3 مرات.</li>
	<li>قم بطرد مركزي التعليق عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الصب.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام 5 مل من PBS وطردها مركزيا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وتخلص بعناية من أي مادة طافية متبقية حول فم الأنبوب وعلى جدار الأنبوب باستخدام الشفط الفراغي. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط العدلات.</li>
	<li>عد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الدم. عادة ، تم الحصول على 1 إلى 4 × 107 العدلات من 8 مل من دم الإنسان. ملاحظة: قد يكون هناك تلوث لخلايا الدم الحمراء في تعليق العدلات. لا تؤثر خلايا الدم الحمراء بشكل كبير على معظم المقايسات ويمكن أن تمنع تنشيط / تحضيرالعدلات 27. يجب تحليل خلايا الدم الحمراء قبل العد للحصول على تركيز دقيق للعدلات. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى 891 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات لمدة 10-30 ثانية لتحلل خلايا الدم الحمراء ، ثم أضف 99 ميكرولتر من 10× PBS لموازنة الضغط التناضحي ، ومنع تحلل العدلات.</li>
	<li>اضبط كثافة الخلية على 6.25 × 105 خلايا / مل عن طريق إضافة وسط العدلات.</li>
</ol>3. تحضير لوحة 384 بئر
<ol><li>في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، ادمج 1 مل من محلول الأجسام المضادة (1.2 ميكروغرام / مل mAb24-APC) مع 0.2 مل من وسط العدلات لإنشاء محلول mAb24-APC 1 ميكروغرام / مل. ثم أضف 25 ميكرولتر من هذا الخليط إلى آبار التحكم السلبية في صفيحة 384 بئرا (الآبار الزرقاء في الشكل 1).</li>
	<li>في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، امزج 9 مل من محلول الجسم المضاد مع 21.6 ميكرولتر من محلول fMLP (100 ميكرومتر) و 1.7784 مل من وسط العدلات لإنشاء محلول يحتوي على 1 ميكروغرام / مل mAb24-APC و 200 نانومتر fMLP. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من هذا الخليط إلى آبار التحكم والاختبار الإيجابية في صفيحة 384 بئرا (الآبار الحمراء والزرقاء في الشكل 1).</li>
	<li>انقل 5 ميكرولتر من المحاليل المركبة 100 ميكرومتر من لوحة المكتبة المركبة إلى لوحة 384 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي السائل لمدة 1 دقيقة في 500 × غرام ، في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: بالنسبة لألواح الطرد المركزي ، يلزم وجود دوار دلو متأرجح وجرافات لوحة.</li>
</ol>4. علاج الخلايا
<ol><li>أضف 20 ميكرولتر من معلق العدلات إلى كل بئر باستخدام ماصة ذات 16 قناة (نطاق 5-50 ميكرولتر ، لكل عمود من لوحة 384 بئر). امزج بلطف 5-10 مرات باستخدام الماصة ، مع الحفاظ على فاصل زمني ثابت بين كل ماصة. ملاحظة: التركيزات النهائية في الآبار هي كما يلي: العدلات 2.5 × 105 خلايا / مل (جميع الآبار) ؛ mAb24-APC 0.5 ميكروغرام / مل (جميع الآبار) ؛ fMLP 100 نانومتر (آبار التحكم والاختبار الإيجابية) ؛ المركبات 10 ميكرومتر (اختبار الآبار).</li>
	<li>احتضن اللوحة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة ، في درجة حرارة الغرفة (RT) ، لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>قم بإصلاح الخلايا بإضافة 3 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى كل بئر باستخدام ماصة ذات 16 قناة (تركيز PFA النهائي ~ 0.91٪). ثم احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. ملاحظة: يوصى بالحفاظ على فاصل زمني ثابت بين الأعمدة المختلفة عند إضافة العدلات و PFA. هذا يضمن أن العدلات في كل بئر لها نفس وقت الحضانة مع fMLP و mAb24-APC.</li>
</ol>5. قياس التدفق الخلوي
<ol><li>قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) ، وتأكد من تشغيل الكمبيوتر المتصل بالجهاز أيضا.</li>
	<li>تأكد من ملء حاوية سائل الغمد ، وأن حاوية النفايات فارغة ومتصلة بشكل صحيح بالجهاز.</li>
	<li>قم بتحميل لوحة 384 بئرا على محمل العينة الخاص بمقياس التدفق الخلوي. تأكد من محاذاة بئر A1 للوحة مع علامة A1 الموجودة على اللودر.</li>
	<li>افتح البرنامج وأنشئ تجربة جديدة. حدد 384 جيدا واختر الفلوروفورات المطلوبة. بعد ذلك ، انقر فوق إعداد اللوحة ، واسحب لتحديد جميع الآبار ، ثم انقر فوق عينة. قم بتشغيل مفتاح "الإنتاجية العالية" ، وحدد مرتفع ضمن لوحة المعدل.<ol><li>في مربع مستوى الصوت، أدخل 50. حدد عينات في أعمدة ذات أرقام فردية ثم قم بتنشيط مفتاح "التحريض". أخيرا ، قم بتسمية العينات في اللوحة اليمنى.</li>
	</ol></li>
	<li>انقر فوق مؤامرة وبوابة. ثم ، انقر فوق الزر "تطبيق" (سهمان على دائرة مملوءة باللون الأخضر) ، وبعد ذلك ، انقر فوق زر التشغيل (شكل مثلث). انتظر بضع ثوان لمراقبة بعض الخلايا من البئر الأول ، ثم انقر فوق زر الإيقاف المؤقت .<ol><li>اضبط الفولتية FSC و SSC لضمان التصور المناسب للخلايا على قطعة الأرض. انقر فوق اكتساب ، ثم انقر فوق زر التشغيل (شكل مثلث) لبدء الفحص.</li>
	</ol></li>
	<li>سيقوم مقياس التدفق الخلوي بأخذ عينات بالتتابع ~ 50 ميكرولتر من 1000-3000 عدلة من كل بئر. سوف يستغرق الأمر حوالي 3 ساعات لإكمال اللوحة المكونة من 384 بئرا بالكامل.</li>
	<li>بعد الانتهاء من جميع العينات ، قم بتصدير ملفات .fcs للخطوة التالية.</li>
</ol>6. تحليل البيانات
<ol><li>افتح برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). حدد المجلد الذي يحتوي على جميع ملفات .fcs واسحبه إلى نافذة البرنامج ، ثم حرره لاستيراد البيانات إلى البرنامج.</li>
	<li>انقر نقرا مزدوجا فوق عينة واحدة ، بوابة العدلات المفردة بناء على FSC و SSC28،29،30 في النافذة المنبثقة ، كما هو موضح في الشكل 3. حدد الصفوف المسورة واسحبها إلى المجلد ، ثم حررها لتطبيق البوابات على جميع العينات الموجودة في هذا المجلد.</li>
	<li>حساب وتصدير متوسط كثافة مضان APC (MFI) للعدلات من كل بئر باستخدام وظيفة محرر الجدول الخاصة بالبرنامج. انقر فوق إضافة عمود ضمن علامة التبويب تحرير . حدد الوسيط في علامة التبويب إحصائية ، واختر العدلات السكانية المسورة ، وحدد APC كمعلمة. انقر فوق الزر "موافق ".</li>
	<li>ارجع إلى علامة التبويب "محرر الجدول" ، وحدد جميع العينات في علامة التبويب "تجميع" ، واضغط على زر إنشاء جدول . ستظهر نافذة جديدة تعرض الجدول الذي تم إنشاؤه. احفظه كملف نصي أو ملف CSV أو Excel.</li>
	<li>افتح الجدول المصدر ، واحسب متوسط القيمة والانحراف المعياري ل APC MFI لعينات التحكم الإيجابية والسلبية (الشكل 4).</li>
	<li>احسب عامل Z'-factor (Z') للوحة باستخدام المعادلة: Z' = 1 - 3 (σ p + σ n) / (μp - μn) ، حيث σ p و σ n هما الانحرافات المعيارية للضوابط الإيجابية والسلبية ، على التوالي ، و μp و μn هما وسائل الضوابط الإيجابية والسلبية ،على التوالي 31. ملاحظة: يشير العامل Z إلى فصل توزيعات التحكم الموجبة والسالبة. Z 'من 0 تعني عدم وجود فصل ، بينما يشير Z' من 0.5 إلى فصل متساو. كما ذكرنا في دراسة سابقة31 ، يشير Z '> 0.5 إلى اختبار ممتاز للفحص المركب. A Z 'في نطاق 0.5 إلى 0 مقبول ، لكنه قد يحدد فقط النتائج القوية في الفحص ، الأمر الذي سيتطلب مزيدا من التحقق في المقايسات الثانوية.</li>
	<li>اعتبر المركبات "ضربات" للفحص عندما يكون APC MFI للعدلات المعالجة بالمركبات أقل من ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري ل MFI للتحكم الإيجابي مطروحا من MFI للتحكم الإيجابي (P = 0.0013 ، ممثلة بالخط المنقط في الشكل 4).</li>
</ol>

فحص مثبطات تنشيط الإنتيرين β2 في العدلات البشرية

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

يتم تحديد بدء وإنهاء تحفيز العدلات وتلطيخها عن طريق إضافة العدلات و PFA المثبت. لذلك ، فإن ضمان نفس الفاصل الزمني بين العدلات الماصة أو PFA في كل عمود أمر بالغ الأهمية. هذا يضمن أن وقت التحفيز وتلطيخ العدلات من كل بئر لا يزال ثابتا. نظرا لقصر عمر العدلات ، يجب إجراء التجربة بأكملها ، من جمع الدم...

تتميز العديد من الأمراض الالتهابية بتسلل العدلات في موقع التورم أو الإصابة1. للتسلل إلى هذه الأنسجة ، يجب أن تكمل العدلات سلسلة تجنيد العدلات ، والتي تنطوي على الاعتقال إلى البطانة ، والإسراف عبر جدار الوعاء الدموي ، والتجنيد في الأنسجة2. تحتاج العدلات المتداولة إلى تنشيط β2 integrin لإكمال هذا الشلال ، خاصة لمرحلة الاعتقال. وبالتالي ، فإن الأدوية المثبطة للإنتغرين التي تقلل من التصاق العدلات ، والإسراف ، والتوظيف قد تعالج الأمراض الالتهابية بشكل فعال 3,4.
تم استهداف β2 integrins للأمراض الالتهابية من قبل. تم تطوير Efalizumab ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة يستهدف مباشرة integrin αLβ2 ، لعلاج الصدفية5. ومع ذلك ، تم سحب efalizumab بسبب آثاره الجانبية القاتلة - اعتلال بيضاء الدماغ متعدد البؤر التدريجي الناتج عن إعادة تنشيط فيروس JC 6,7. يجب أن تأخذ العلاجات الجديدة القائمة على الإنتيرين المضادة للالتهابات في الاعتبار الحفاظ على الوظائف المضادة للعدوى في كريات الدم البيضاء لتقليل الآثار الجانبية. قد تكون الآثار الجانبية لإفاليزوماب بسبب الدوران المطول للأجسام المضادة وحيدة النسيلة في مجرى الدم ، والتي يمكن أن تمنع وظائف المناعة على المدىالطويل 8. أظهرت دراسة حديثة أن efalizumab يتوسط التشابك αLβ2 والاستيعاب غير المرغوب فيه ل α4 integrins ، مما يوفر تفسيرا بديلا للآثار الجانبية9. وبالتالي ، قد تتجنب مضادات الجزيئات الصغيرة قصيرة العمر هذه المشكلة.
يتم تقديم طريقة عالية الإنتاجية لفحص مضادات الميكروين β2 ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام العدلات البشرية هنا. يتطلب تنشيط Β2 Integrin تغييرات توافقية في المجال الخارجي للإنتغرين للوصول إلى وزيادة تقاربه المرتبط برابطته. في نموذج شفرة التبديل المتعارف عليها ، يمتد المجال الخارجي للإنتغرين المغلق المنحني أولا إلى شكل مغلق ممتد ثم يفتح غطاء رأسه إلى تشكيل مفتوح ممتد نشط بالكامل10،11،12،13. هناك أيضا مسار بديل يبدأ من الانحناء المغلق إلى الانحناء المفتوح والممتد المفتوح ، في النهاية14،15،16،17،18،19. يرتبط الجسم المضاد الخاص بالتشكل mAb24 بخاتمة في المجال البشري الشبيه ب β2-I عندما يكون غطاء رأس المجال الخارجي مفتوحا20،21،22،23.
هنا ، يتم استخدام mAb24-APC لتحديد ما إذا كان يتم تنشيط β2 integrins. لتنشيط العدلات والانتغرين ، يتم استخدام N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) ، وهو ببتيد كيميائي قصير مشتق من البكتيريا يمكنه تنشيط العدلات β2 integrins24 ، كحافز في هذا البروتوكول. عندما يرتبط fMLP ب Fpr1 على العدلات ، يتم تنشيط شلالات إشارات المصب التي تتضمن بروتينات G و phospholipase Cβ و phosphoinositide 3-kinase γ. تؤدي أحداث الإشارة هذه في النهاية إلى تنشيط integrin عبر مسار الإشارات من الداخل إلى الخارج18,25. إلى جانب مضادات الجزيئات الصغيرة التي ترتبط مباشرة ب β2 integrins وتمنع التغيرات التوافقية لتنشيط integrin26 ، سيتم أيضا اكتشاف المركبات التي يمكن أن تمنع المكونات في مسار إشارات التنشيط β2 integrin من الداخل إلى الخارج باستخدام هذه الطريقة. تتيح مقاييس التدفق الخلوي الآلية الفحص عالي الإنتاجية. قد لا يؤدي تحديد الخصوم الجدد إلى تعميق فهمنا لفسيولوجيا الأنتغرين فحسب ، بل يوفر أيضا نظرة ثاقبة متعدية للعلاج المضاد للالتهابات القائم على الأنتغرين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء طريقة لتحديد المضادات الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 integrin ، باستخدام الأجسام المضادة للإبلاغ عن التغيير المطابق وقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية. يمكن أن تكون الطريقة أيضا بمثابة دليل لطرق الفحص الأخرى عالية الإنتاجية القائمة على الأجسام المضادة. β2 integrins هي جزيئات التصاق خاصة بالكريات البيض والتي تعتبر حاسمة في الاستجابات المناعية. تعتمد العدلات على تنشيط الإنتغرين للخروج من مجرى الدم ، ليس فقط لمكافحة العدوى ولكن أيضا للمشاركة في أمراض التهابية متعددة. يمثل التحكم في تنشيط β2 integrin نهجا قابلا للتطبيق لعلاج الأمراض الالتهابية المرتبطة بالعدلات. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جسم مضاد وحيد النسيلة ، mAb24 ، والذي يرتبط على وجه التحديد بغطاء الرأس عالي التقارب ل β2 integrins ، لتحديد تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية الأولية المعزولة. يستخدم N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) كحافز لتنشيط العدلات β2 integrins. تم استخدام مقياس خلوي عالي الإنتاجية قادر على تشغيل عينات صفيحة 384 بئرا تلقائيا في هذه الدراسة. يتم تقييم آثار 320 مادة كيميائية على تثبيط β2 integrin في غضون 3 ساعات. يمكن تحديد الجزيئات التي تستهدف مباشرة β2 integrins أو الجزيئات المستهدفة في مسار إشارات التنشيط من الداخل إلى الخارج الذي بدأه مستقبلات البروتين G من الداخل إلى الخارج من خلال هذا النهج.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير طريقة لتحديد الخصوم الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 Integrin 

تقنية عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لفحص الأدوية المثبطة للإنتغرين

Our research is focused on neutrophil integrin, and in this study we aim to establish a method to find small molecular antagonists of Beta-2 integrin activation. We believe with this method we can find new antagonists that may deepen our understanding in integrin physiology, and also provide translational insight into integrin-based anti-inflammatory therapy. In the future, we will focus on discovering new anti-inflammatory drugs and dissecting their mechanisms of action.

كشفت البيانات المأخوذة من فحص لوحة 384 بئرا تمثيليا (الشكل 4) أن الضوابط السلبية تحتوي على MFI من mAb24-APC من 3236 ± 110 ، بينما كان للضوابط الإيجابية MFI من mAb24-APC من 7588 ± 858. يبلغ عامل Z لهذه اللوحة حوالي 0.33 ، وهو ضمن نطاق مقبول31. ومع ذلك ، يتطلب Z مزيدا من التحقق في المقايسات ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of β2 Integrin Activation at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول طريقة فحص عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة التي تمنع تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

يركز بحثنا على إنتغرين العدلات ، وفي هذه الدراسة نهدف إلى إنشاء طريقة للعثور على مضادات جزيئية صغيرة لتنشيط Beta-2 integrin. نعتقد أنه باستخدام هذه الطريقة يمكننا العثور على خصوم جدد قد يعمقون فهمنا في فسيولوجيا الأنتغرين ، ونوفر أيضا نظرة ثاقبة متعدية للعلاج المضاد للالتهابات القائم على الأنتغرين. في المستقبل ، سنركز على اكتشاف أدوية جديدة مضادة للالتهابات وتشريح آليات عملها.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K Views.  UConn Health. يركز بحثنا على إنتغرين العدلات ، وفي هذه الدراسة نهدف إلى إنشاء طريقة للعثور على مضادات جزيئية صغيرة لتنشيط Beta-2 integrin. نعتقد أنه باستخدام هذه الطريقة يمكننا العثور على خصوم جدد قد يعمقون فهمنا في فسيولوجيا الأنتغرين ، ونوفر أيضا نظرة ثاقبة متعدية للعلاج المضاد للالتهابات ا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير طريقة لتحديد الخصوم الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 Integrin 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.