Cell-Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

127 Views

•

02:00 min

•

January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200817-v

January 12th, 2024

•

Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

Transcript

للبدء ، أضف 70 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتكييف لكل ملليلتر من المخالفة الخالية من الخلايا لفكاهة العين. دوامة حبات المقاصة لخلط جيدا. بعد ذلك ، أضف الخرزات إلى العينة ، ثم دوامة العينة ومخاليط الخرز.

أجهزة الطرد المركزي هذا المزيج في 3000 غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدون إزاحة الحبيبة, استخراج supernate ، ثم إضافة حجم متساو من البول بيليه الهضم العازلة إلى بيليه. ماصة الحل صعودا وهبوطا لإعادة تعليق بيليه.

أضف الآن البروتيناز K إلى خليط الحبيبات المعاد تعليقه. احتضن الخليط عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم أضف حجما متساويا من محلول التحلل الجيني إلى خليط الهضم. دوامة الحل جيدا لمزجها جيدا.

الآن ، ضع عمود الدوران المتاح تجاريا في أنبوب تجميع جديد. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعداد الحمض النووي للبول إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل التدفق.

الآن ماصة 700 ميكرولتر من الحمض النووي للبول غسل العازلة للعمود وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح. بعد التخلص من التدفق ، انقل عمود الدوران إلى أنبوب طرد مركزي صغير خال من DNase وخالي من RNase. أخيرا ، أضف الحجم المناسب من المخزن المؤقت لشطف الحمض النووي مباشرة إلى مصفوفة العمود ، واتركه لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم الطرد المركزي مرة أخرى للحصول على الحمض النووي الخالي من الخلايا.

كانت غلة الحمض النووي لكل من المكونات الخلوية والخالية من الخلايا في سوائل العين متشابهة. تم إجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل للمكونات الخلوية والخالية من الخلايا للطفرة المرتبطة بسرطان الغدد الليمفاوية الزجاجية. كان معدل طفرة أعلى موجودا في المكون الخالي من الخلايا ، كما يتضح من عتبة الدورة المنخفضة.

Explore More Videos

Vitreoretinal Lymphoma

PCR Analysis

DNA Yield

Conditioning Buffer

Urine Pellet Digestion Buffer

Genomic Lysis Buffer

Urine DNA Prep Buffer