للبدء ، في صفيحة من ستة آبار ، بذر ملليلتر واحد من خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T . أضف ملليلتر من DMEM الكامل. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط جديد خال من المضادات الحيوية لإعداد الخلايا للنقل.
لنقل الخلايا الملتصقة ، أولا ، قم بإعداد المزيج A عن طريق إضافة الحمض النووي البلازميد إلى 100 ميكرولتر من Opti-MEM. بعد ذلك ، أضف 17.5 ميكرولتر من البولي إيثيلين إلى 100 ميكرولتر من Opti-MEM. امزج محتويات المزيج A و B ، ثم احتضان.
أثناء الحضانة ، حرك الأنبوب برفق كل ثلاث إلى أربع دقائق لتعزيز الخلط. أضف الحجم الكامل للخليط إلى اللوحة باستخدام خلايا HEK 293T. بعد 16 إلى 20 ساعة من النقل ، استبدل وسط الاستزراع ب DMEM الكامل الجديد.
احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لإنتاج فيروسات النمط الزائف. بعد 72 ساعة من النقل ، احصد المادة الطافية في أنبوب تجميع. أجهزة الطرد المركزي طاف في 1،600 غرام لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح أسيتات السليلوز 0.45 ميكرومتر. توزيع 50 ميكرولتر من DMEM الكامل في آبار لوحة 96 بئر. اترك الصف A فارغا.
أضف 100 ميكرولتر من مخزون الفيروس الكاذب إلى الآبار في الصف A.بعد ذلك ، ماصة 50 ميكرولتر من المحلول من الصف A إلى B.كرر هذه العملية حتى الصف G للحصول على التخفيفات التسلسلية. قم بإزالة الوسط المستنفد من صفيحة تحتوي على خلايا HEK 293T ACE2 حساسة مستزرعة ، واغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من DPBS. ثم افصل الخلايا بمليلتر واحد من التربسين EDTA في محلول ملحي DPBS.
أضف الآن 50 ميكرولترا من تعليق الخلية الحساسة في كل بئر يحتوي على فيروسات النمط الزائف. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. أضف 100 ميكرولتر من كاشف لوسيفيراز إلى كل بئر.
بعد الحضانة ، انقل محتويات كل بئر إلى لوحة سوداء من 96 بئرا. ثم اقرأ اللوحة في قارئ اللوحة. في لوحة 96 بئرا ، أضف 50 ميكرولترا من DMEM الكامل الطازج إلى الأعمدة من الأول إلى 10 من الصفوف B إلى H.أضف 95 ميكرولترا من DMEM الكامل الطازج إلى الآبار المقابلة للصف A.أضف الآن 50 ميكرولترا من DMEM الكامل إلى الآبار في العمود 11 و 100 ميكرولتر من DMEM إلى العمود 12.
ماصة خمسة ميكرولتر من عينات المصل المعطل بالحرارة إلى الصف A.باستخدام ماصة متعددة القنوات ، امزج العينات في الصف الأول وانقل 50 ميكرولترا من المصل المحتوي على متوسط من الصف A إلى B حتى الصف H.وزع 50 ميكرولترا من الفيروس الكاذب المخفف المحتوي على وسط لكل بئر من الأعمدة من الأول إلى 11. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. تحضير تعليق لخلايا ACE2 الحساسة HEK293T في خمسة ملليلتر.
أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى كل بئر ، ثم احتضان قبل إجراء فحص لوسيفيراز. أدى انخفاض تخفيف المصل إلى انخفاض دخول الفيروس إلى الخلايا. وهذا ما تؤكده زيادة نسبة التحييد.
