ونعترف بمساهمة المتطوعين العاملين في مجال الرعاية الصحية. تم دعم هذا المشروع من قبل إدارة التميز 2023/2027 ، MUR ، إيطاليا. تم دعم AR و DZ من قبل PRIN2022 (تمويل الاتحاد الأوروبي; الجيل القادمالاتحاد الأوروبي)

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة فيرونا ويتبع المبادئ التوجيهية لها (رقم بروتوكول الموافقة 1538). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص المشاركين في الدراسة. تم جمع عينات الدم الكامل من متطوعي العاملين في مجال الرعاية الصحية (HCW) الذين كانوا بصدد تلقي لقاحات مضادة ل SARS-CoV-2. تم جمع هذه العينات في أنابيب بلاستيكية تحتوي على مضادات التخثر للعزل اللاحق للمصل15.
يجب إجراء جميع العمليات التالية في غطاء بيولوجي من الفئة 2 ، يعمل في ظل ظروف معقمة. يجب إجراء معالجة الفيروسات بعناية ، ويجب تحييد جميع منتجات النفايات في محلول مبيض مخفف. يتم عرض نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> الشكل 1: تمثيل بياني لمقايسة التحييد. (أ) إنتاج الكهروضوئية، (ب) معايرة الطاقة الكهروضوئية، (ج) مقايسة التحييد. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء بيولوجي من الفئة 2 في ظل ظروف معقمة. يجب إجراء خطوة المعايرة (B) لتوحيد مستويات العدوى للخلايا الكهروضوئية قبل استخدامها في مقايسة التحييد (C). تم إنشاء هذا الرقم باستخدام BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
1. اختبار إنتاج وعدوى SARS-CoV-2 PVs
<ol><li>بذر 5 × 105 خلايا HEK293T في وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مصل بقري الجنين 10٪ (FBS) ، 1٪ L-glutamine ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) في صفيحة ذات 6 آبار (6WP) للوصول إلى كثافة خلية مناسبة متوافقة مع كاشف النقل المستخدم. في حالة إجراء النقل باستخدام polyehtylenimine (PEI) (تحضير الكاشف باتباع تعليمات الشركة المصنعة) ، تأكد من أن الخلايا تصل إلى كثافة 40-60٪ في يوم النقل (الخطوة 1.3). الحفاظ على الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>قبل النقل ، استبدل وسط الخلية المستهلك بوسط جديد بدون مضادات حيوية (DMEM ، جلوكوز عالي ، 10٪ FBS ، 1٪ L-glutamine) لتحقيق كفاءة نقل أعلى. ملاحظة: في اليوم التالي للبذر ، تكون خلايا HEK293T جاهزة للنقل.</li>
	<li>نقل الخلايا HEK293T الملتصقة بكاشف نقل مناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في حالة استخدام جزيرة برنس إدوارد ، قم بإعداد مزيجين واتبع الخطوات أدناه.<ol><li>لتحضير المزيج A ، أضف 500 نانوغرام من بلازميد التغليف pCMV-dR8.9116 ، و 750 نانوغرام من بلازميد مراسل pCSFLW16 ، و 450 نانوغرام من SARS-CoV-2 Spike الذي يعبر عن البلازميد في 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل.</li>
		<li>لتحضير المزيج B ، أضف 17.5 ميكرولتر من PEI (التركيز: 1 مجم / مل) إلى 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل.</li>
		<li>اترك كلا المزيجين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، امزج محتويات كلا الأنبوبين معا عن طريق إضافة مزيج PEI B إلى مزيج DNA A .</li>
		<li>احتضن الأنبوب لمدة 20-30 دقيقة في RT. حرك الأنبوب برفق كل 3-4 دقائق لتعزيز الخلط. أخيرا ، أضف الخليط إلى الخلايا HEK293T.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد 16-20 ساعة من النقل ، استبدل وسيط الاستزراع ب DMEM جديد وكامل. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 ، للسماح بإنتاج PVs بواسطة الخلايا المنقولة.</li>
	<li>72 ساعة بعد النقل ، احصد المادة الطافية التي تحتوي على PVs. ثم أجهزة الطرد المركزي عند 1600 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة حطام الخلايا والخلايا الميتة وتصفيتها من خلال مرشح خلات السليلوز 0.45 ميكرومتر.</li>
	<li>خطوة اختيارية: لزيادة العائد النهائي للعيار الكهروضوئي ، قم بإجراء عمليات نقل متعددة ، وتجميع وسائط الخلية التي تحتوي على PVs ، وتركيزها باستخدام أنابيب التركيز.</li>
	<li>تابع مباشرة الخطوات التالية ("معايرة PVs" ، القسم 2) أو قسمة الوسط المحتوي على PV في أنابيب مناسبة لتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. قم بإعداد قسمة إضافية (400-500 ميكرولتر) لاستخدامها في المعايرة. ملاحظة: سيضمن عمل حصص متعددة قابلية التكاثر بين التجارب عن طريق تجنب دورات الذوبان والتجميد المفرطة.</li>
</ol>2. معايرة PVs
<ol><li>استخدم الوسط الطازج المحتوي على PV للخطوات التالية أو قم بإذابة قسمة الاختبار (الخطوة 1.7) لإجراء معايرة المخزون الفيروسي الجديد. سيضمن تجميد الحصص من نفس المخزون الكهروضوئي قابلية التكاثر.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من DMEM الكامل (أو الوسط الكامل المتوافق مع خط الخلية المستهدف قيد الاستخدام) في جميع آبار 96 صفيحة بئر (96WP) اللازمة لاختبار المخزون الكهروضوئي المكرر ، مع ترك الصف "A" فارغا. أضف 100 ميكرولتر من مخزون PVs إلى الصف "A". بناء على عدد المستحضرات المراد اختبارها ، اترك عمودا واحدا بدون الفيروس كعنصر تحكم "خلية فقط" (الشكل 2).</li>
	<li>ماصة 50 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B وكرر هذه العملية حتى الصف G للحصول على التخفيفات التسلسلية للمخزون الأولي. تجاهل الحجم الزائد من الصف الأخير.</li>
	<li>فصل الخلايا باستخدام حمض التربسين / الإيثيلين ديامينيترايتيك 1x (EDTA) في محلول ملحي فوسفات Dulbecco 1x (DPBS 1x) ، بعد إزالة الوسط المستهلك وغسل الخلايا باستخدام DPBS 1x مرتين. تحضير الخلايا بكثافة 4 × 105 خلايا / مل. ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم اختبار عدوى PVs على خط الخلية الحساسة HEK293T / ACE2 ؛ تم اشتقاق هذه الخلايا من HEK293T ، وتم تحويلها باستخدام ناقل عدسي فيروسي للتعبير عن مستقبلات ACE2.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر لضمان عدد خلايا 2 × 104 خلايا لكل بئر.</li>
	<li>احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 ، لمدة 48 ساعة.</li>
	<li>بعد الحضانة ، قم بإجراء اختبار Luciferase للحصول على القراءة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 100 ميكرولتر من كاشف لوسيفيراز إلى الآبار واحتضانها في الظلام في RT لمدة 2 دقيقة. انقل محتوى كل بئر إلى لوحة بئر سوداء 96 (متوافقة مع قارئ الألواح المتاح) واقرأ الألواح في قارئ لوحة بئر 96. ملاحظة: سينتج مقياس الإنارة المستخدم في قراءات لوسيفيراز ملف جدول بيانات يحتوي على البيانات الأولية غير المعالجة التي سيتم استخدامها لتحليل المصب (في هذه الحالة ، ملف Excel). سيتم التعبير عن عدوى الفيروس كوحدات تلألؤ نسبية (RLU) (موصوفة في الفقرة 4.1).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> الشكل 2: تخطيط تمثيلي للوحة بئر 96 لمعايرة الخلايا الكهروضوئية. يضاف حجم ثابت من المادة الطافية المحتوية على PV إلى الصف A ، الأعمدة 1-11 ، ويتم تخفيفه بشكل متسلسل. يتم ترك العمود الأخير كعنصر تحكم "الخلية فقط". تم إنشاء هذا الرقم باستخدام BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
3. مقايسة التحييد
<ol><li>ذوبان الأمصال المرضى على الجليد. قم بتعطيل عينات المصل عن طريق احتضانها على حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>في صفيحة بئر 96 ، أضف 50 ميكرولتر من DMEM الطازج والكامل (أو الوسط الكامل المتوافق مع خط الخلية المستهدف المستخدم) في كل من الآبار التالية: من الصف B (الأعمدة 1-10) إلى الصف H (الأعمدة 1-10). ضع 95 ميكرولتر من DMEM الطازج والكامل في الصف A (الأعمدة 1-10). أضف 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من DMEM الكامل إلى آبار العمودين 11 و 12 على التوالي. ستكون هذه هي عناصر التحكم المصابة (مكافحة الفيروسات ، أو VC) وغير المصابة (الخلية فقط ، أو CC) ، على التوالي (الشكل 3).</li>
	<li>أضف 5 ميكرولتر من عينات المصل / البلازما المعطلة بالحرارة في الصف A (الأعمدة 1-10). ستكون كل عينة من نسختين. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، امزج العينات في الصف الأول وانقل 50 ميكرولتر من المصل المحتوي على وسط من الصف A إلى الصف B. كرر هذه العملية حتى الصف الأخير (الشكل 3). تخلص من ال 50 ميكرولتر المتبقية.</li>
	<li>قم بإذابة العدد اللازم من حصص PVs وقم بتخفيفها إلى ≥ 104 RLU / mL. أضف 50 ميكرولتر من الوسط المحتوي على PV المخفف إلى كل بئر (من العمود 1 إلى العمود 11) باستخدام ماصة متعددة القنوات للوصول إلى تخفيف 1: 1 من المصل / البلازما المعطل بالحرارة إلى الفيروس. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، لمدة 1 ساعة للسماح للأجسام المضادة في عينات المصل بالارتباط ببروتين ارتفاع SARS-CoV-2 على PVs.</li>
	<li>تحضير ما لا يقل عن 5 مل معلق للخلايا الحساسة (HEK293T / ACE2) بكثافة خلية 4 × 105 خلايا / مل. أضف 50 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، لمدة 48 ساعة.</li>
	<li>بعد الحضانة ، قم بإجراء قراءة مقايسة luciferase وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، كما هو موضح في الخطوة 2.7. ملاحظة: سينتج مقياس الإنارة المستخدم في قراءات لوسيفيراز ملف جدول بيانات (في هذه الحالة ، .xlsx) مع البيانات الخام غير المعالجة التي سيتم استخدامها لتحليل المصب (ملف فحص Luciferase ).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> الشكل 3: تمثيل اللوحة على أساس تخفيف المصل. يتوافق اللون الأحمر الفاتح مع كمية أكبر من المصل ، ويتوافق الممر الأزرق الساطع (العمود 11) مع التحكم في الخلايا المصابة (VC ، مكافحة الفيروسات). الممر الأزرق الفاتح (العمود 12) يتوافق مع الخلايا غير المصابة (CC ، التحكم في الخلية). تم إنشاء هذا الرقم باستخدام BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
4. تحليل المعايرة بالتحليل الحجمي
<ol><li>في ملف فحص Luciferase ، قم بتعيين الأسماء / العناوين للعينات المقابلة.</li>
	<li>اضرب مقياس RLU في عوامل التخفيف (من أعلى الشبكة إلى أسفلها: 20x ، 40x ، 80x ، 160x ، 320x ، 640x ، 1,280x ، 2,560x) للحصول على RLU / mL. إذا تم استخدام عوامل تخفيف مختلفة ، فقم بتغيير عوامل الضرب وفقا لذلك.</li>
	<li>احسب متوسط RLU / mL لكل تحضير PV.</li>
</ol>5. تحليل مقايسة تحييد PVs
<ol><li>في ملف جدول بيانات فحص Luciferase (في هذه الحالة ، .xlsx) ، قم بتعيين العناوين المقابلة للعينات التي تم اختبارها. أدخل عامل التخفيف للعينة (40 ثانية ، 80 ضعفا ، 160 ضعفا ، 320 ضعفا ، 640 ضعفا ، 1280 × ، 2560 × ، 5120 ضعفا). احسب log10 لعوامل التخفيف.</li>
	<li>احسب متوسط RLU للسيطرة غير المصابة والمصابة (الشكل 3 ، العمودين 11 و 12 ، على التوالي). ستكون هذه القيم مفيدة للتطبيع في الخطوة 5.5.</li>
	<li>افتح مستندا جديدا لتحليل البيانات. حدد تحليل X / Y ، وأدخل X كأرقام و Y ك Enter 2 قيم النسخ المتماثل في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب.</li>
	<li>أدخل قيم Log10 (التخفيف) كأرقام X. أدخل RLU المكررة للعينات.</li>
	<li>انتقل إلى تحليل > تطبيع > وضع علامة على جميع العينات الموجودة على نفس الورقة. أدخل متوسط قيم VC و CC في كيف يتم تعريف 0٪؟، وكيف يتم تعريف 100٪؟، على التوالي. انقر فوق موافق.</li>
	<li>في ورقة البيانات التي تمت تسويتها، انتقل إلى تحليل > تحليلات XY > التحليلات غير الخطية (ملاءمة المنحنى). ضع علامة على كافة العينات وانقر فوق موافق. بالنسبة لاستجابة الجرعة - التثبيط ، حدد log (المانع) مقابل الاستجابة الطبيعية - المنحدر المتغير.</li>
	<li>ضمن قيد ، قم بتغيير HillSlope إلى يجب أن يكون أقل من 0.</li>
	<li>ضمن الإخراج، ضع علامة على إنشاء جدول ملخص ورسم بياني. انقر فوق موافق للحصول على التحليلات النهائية. وترد في الملف التكميلي 1 صحيفة عمل تتضمن نموذجا للتحليل.</li>
</ol>

تقييم تحييد المصل ضد SARS-CoV-2 مع الفيروسات الزائفة

<ol>
	<li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials.">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963 (2012).</li><li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections.">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).</li><li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-&#954;B+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway.">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-&#954;B signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).</li><li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine,+antiviral-drugs,+and+neutralizing+antibodies.">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993 (2022).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).</li><li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern:+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay.">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).</li><li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses:+current+challenges+and+perspectives.">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li><li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+pseudotypes:+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy.">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016 (2020).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fourth+generation+lentiviral+Vector:+Simplifying+genomic+gymnastics.">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li><li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71.">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116 (2013).</li><li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins:+application+in+vaccine+immunogenicity,+mAb+potency,+and+sero-surveillance+studies.">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2.">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes &amp; Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li><li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na&#239;ve.">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus na&#239;ve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).</li><li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+titration,+neutralisation,+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+(SARS-CoV-2)+lentiviral+pseudotypes.">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).</li><li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bie&#324;kowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants:+The+role+of+neutralization+assays.">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells.">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li><li>Gauger, P. C., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+virus+neutralization+assay+for+detection+and+quantitation+of+serum+neutralizing+antibodies+to+influenza+A+virus+in+swine.">Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).</li><li>Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+in+monoclonal+antibody+neutralization+of+HIV-1+pseudoviruses+and+infectious+molecular+clones.">Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).</li><li>Chen, M., Zhang, X. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+applications+of+SARS-CoV-2+pseudoviruses:+A+mini+review.">Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).</li><li>Zipeto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+immunodeficiency+virus+neutralizing+antibodies+using+fusion+complexes.">Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes.</a> Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).</li><li>WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: <a target="_blank" href="https://covid19.who.int">https://covid19.who.int</a> (2022)</li><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin.">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li><li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states.">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).</li><li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection:+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies.">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089 (2022).</li><li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination:+a+mathematical+modelling+study.">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li><li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63,+HKU1,+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms.">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58 (2023).</li><li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na&#239;ve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2.">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in na&#239;ve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).</li><li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na&#239;ve+and+previously+COVID-19-infected+individuals.">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in na&#239;ve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li><li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection.">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471 (2023).</li><li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors.">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).</li><li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+(N1-N9)+and+Influenza+B+(B/Victoria+and+B/Yamagata)+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design.">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).</li><li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays:+a+1-week+protocol.">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).</li><li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity.">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745 (2021).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

على الرغم من أن استخدام فيروس من النوع البري يحاكي العدوى الفعلية ، إلا أن الفيروسات العدسية PVs هي خيار أكثر أمانا لدراسة الآليات المرتبطة بدخول الفيروس والعدوى دون متطلبات السلامة الصارمة اللازمة للعمل مع الفيروسات المسببة للأمراض4،20،21</sup...

الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية تستخدم في علم الأحياء الدقيقة لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف ومسببات الأمراضالممرضة 1،2،3،4. تتكون PVs من جزء داخلي ، النواة الفيروسية التي تحمي الجينوم الفيروسي ، وجزء خارجي ، البروتينات السكرية المغلفة على سطح الفيروس الذي يحدد الانتحاء5. الفيروس الكاذب غير كفء للتكاثر في الخلية المستهدفة لأنه لا يحتوي على جميع المعلومات الوراثية لتوليد جزيئات فيروسية جديدة. هذا المزيج من الميزات الغريبة يجعل PVs بديلا آمنا لفيروس من النوع البري. من ناحية أخرى ، فإن الفيروسات البرية شديدة الإمراض ولا يمكن استخدامها في مختبرات BSL 2 للتحليل6.
يمكن مراقبة عدوى PVs بواسطة جين مراسل ، وعادة ما يتم ترميزه لبروتين فلوري (GFP ، RFP ، YFP) أو إنزيم ينتج منتجات كيميائية مضيئة (luciferase). ويرد هذا في واحدة من البلازميدات المستخدمة لإنتاج الكهروضوئية ودمجها في جينوم الفيروس الكاذب7.
توجد حاليا عدة أنواع من النوى الكهروضوئية ، بما في ذلك الجسيمات المشتقة من العدس بناء على جينوم HIV-1. الميزة الكبيرة للخلايا الكهروضوئية القائمة على فيروس نقص المناعة البشرية -1 على المنصات الأخرى هي عملية التكامل الجوهرية في جينوم الخلية المستهدفة8. على الرغم من أن فيروس HIV-1 هو فيروس شديد العدوى وهو العامل المسبب للإيدز ، إلا أن هذه النواقل الفيروسية عدسية آمنة للاستخدام بسبب خطوات التحسين الواسعة النطاق على مر السنين. تم تحقيق ظروف السلامة المثلى مع إدخال 2 من ناقلات الفيروسات العدسية من الجيلالثاني ، حيث تم استنفاد الجينات الفيروسية دون التأثير على قدرات النقل9. ساهمالجيلين الثالث و 4 في زيادة سلامة التعامل مع ناقلات الفيروسات العدسية مع زيادة تقسيم الجينوم الفيروسي إلى بلازميدات منفصلة10,11. يتم استخدام أحدث أجيال من PVs بشكل عام لإنتاج ناقلات الفيروسات العدسية للعلاج الجيني.
يمكن استخدام PVs لدراسة التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة ، خلال كل من مراحل الإنتاج والعدوى. تستخدم PVs بشكل خاص في مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PVNA). يتم التحقق من صحة PVNAs على نطاق واسع لتقييم إمكانات تحييد المصل أو البلازما من خلال استهداف البروتين السكري الفيروسي على غلاف PV12,13. يتم تعريف نشاط التحييد ، معبرا عنه بالتركيز المثبط 50 (IC50) ، على أنه تخفيف المصل / البلازما الذي يمنع 50٪ من دخول الجسيمات الفيروسية14. في هذا البروتوكول ، وصفنا إعداد PVNA لاختبار نشاط الأجسام المضادة ضد المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة - فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) في الأمصال التي تم جمعها قبل وبعد تلقي جرعة لقاح معززة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10403892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>60005270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D6546 - 500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS 1x)</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism version 7</td>
			<td>graphpad dotmatics</td>
			<td>NA</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;data analysis program&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/ACE2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Victor3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH35000500</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with&#160; &#39;luminometer&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;reduced serum medium&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91 packaging plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCSFLW reporter plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>145839</td>
			<td>This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>pGBW-m4137382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steadylite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6066759</td>
			<td>In the manuscript, we replaced the commercial name with &#39;luciferase reading reagent&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1x</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0949-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pseudotyped viruses as a molecular tool to monitor humoral immune responses against sars-cov-2 via neutralization assay

الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف واختبار القدرة المعادلة لعينات المصل ، بالإضافة إلى استخدامها المعروف في العلاج الجيني لتوصيل جين مهم. PVs معيبة في النسخ المتماثل لأن الجينوم الفيروسي ينقسم إلى بلازميدات مختلفة غير مدمجة في PVs. يسمح هذا النظام الآمن والمتعدد الاستخدامات باستخدام PVs في مختبرات مستوى السلامة البيولوجية 2. هنا ، نقدم منهجية عامة لإنتاج PVs lentiviral على أساس ثلاثة بلازميدات كما هو مذكور هنا: (1) البلازميد الفقري الذي يحمل جين المراسل اللازم لمراقبة العدوى. (2) بلازميد العبوة الذي يحمل الجينات لجميع البروتينات الهيكلية اللازمة لتوليد PVs ؛ (3) تعبير البروتين السكري السطحي المغلف البلازميد الذي يحدد انتحاء الفيروس ويتوسط الدخول الفيروسي إلى الخلية المضيفة. في هذا العمل ، SARS-CoV-2 Spike هو البروتين السكري المغلف المستخدم لإنتاج فيروسات عدسية غير متماثلة من النوع الكاذب SARS-CoV-2.
باختصار ، تم نقل خلايا التغليف (HEK293T) مع البلازميدات الثلاثة المختلفة باستخدام الطرق القياسية. بعد 48 ساعة ، تم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على PVs وتصفيتها وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم اختبار عدوى SARS-CoV-2 PVs من خلال دراسة تعبير الجين المراسل (luciferase) في خط الخلية المستهدف بعد 48 ساعة من الإصابة. كلما زادت قيمة وحدات التلألؤ النسبية (RLUs) ، زاد معدل العدوى / النقل. علاوة على ذلك ، تمت إضافة PVs المعدية إلى عينات المصل المخففة بشكل متسلسل لدراسة عملية تحييد دخول الفيروسات الكاذبة إلى الخلايا المستهدفة ، والتي تم قياسها على أنها انخفاض في كثافة RLU: قيم أقل تتوافق مع نشاط تحييد عالي.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools used in microbiology to study host-virus and pathogen-pathogen interactions1,2,3,4. PVs consist of an inner part, the viral core that protects the viral genome, and an outer part, the envelope glycoproteins on the surface of the virus that defines the tropism5. A pseudovirus is replication-incompetent in the target cell because it does not contain all the genetic information to generate new viral particles. This combination of peculiar features makes PVs a safe alternative to a wildtype virus. Wildtype viruses, on the other hand, are highly pathogenic and cannot be used in BSL 2 laboratories for analysis6.
The infectivity of PVs can be monitored by a reporter gene, usually coding for a fluorescent protein (GFP, RFP, YFP) or an enzyme that produces chemiluminescent products (luciferase). This is contained in one of the plasmids used for PV production and incorporated in the genome of the pseudovirus7.
Several types of PV cores currently exist, including lentiviral-derived particles based on the HIV-1 genome. The great advantage of HIV-1-based PVs over other platforms is their intrinsic integration process in the target cell genome8. Although HIV-1 is a highly contagious virus and is the causative agent of AIDS, these lentiviral vectors are safe to use because of the extensive optimization steps over the years. Optimal safety conditions were achieved with the introduction of 2nd-generation lentiviral vectors, in which viral genes were depleted without influencing transduction capabilities9. The 3rd and 4th generations contributed to the increased safety of lentiviral vector handling with the further splitting of the viral genome into separate plasmids10, 11. The latest generations of PVs are generally employed to produce lentiviral vectors for gene therapy.
PVs can be used to study interactions between viruses and host cells, during both the production and the infection phases. PVs are especially employed in pseudovirus neutralization assays (PVNA). PVNAs are widely validated to assess the neutralization potential of serum or plasma by targeting the viral glycoprotein on the PV&#39;s envelope12,13. Neutralization activity, expressed as the inhibitory concentration 50 (IC50), is defined as the dilution of serum/plasma that blocks 50% of viral particle entry14. In this protocol, we described the set-up of a PVNA to test the antibody activity against Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sera collected before and after receiving a booster vaccine dose.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة تفاعلات الفيروس المضيف مع الفيروسات الزائفة 

الفيروسات الزائفة كأداة جزيئية لمراقبة الاستجابات المناعية الخلطية ضد SARS-CoV-2 عن طريق مقايسة التحييد

Pseudotyped viruses are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test neutralizing activity of serum samples. In the work we present today, a general methodology to produce pseudotyped viruses, based on free plasmid, will be presented. For neutralization assays, Y-type viruses are generally used, but they are highly pathogenic and cannot be handled in a BSL-2 laboratories, rendering this system purely applicable on large scale.The technology of pseudo viruses can be a safer alternative compared to live virus to allow the study of pathogen to host interaction and to test neutralizing activity of antibodies. Future experiments will investigate the role of specific antibodies in the maintenance of immunity after vaccination using the technology of pseudo viruses.

يصف هذا البروتوكول إنتاج الخلايا الكهروضوئية SARS-CoV-2 والتطبيق النهائي لهذه الخلايا الكهروضوئية لتحليل نشاط تحييد المصل / البلازما للأشخاص الذين يتلقون التطعيم المضاد ل COVID-1917. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإنتاج أنماط زائفة لكل متغير مثير للقلق SARS-CoV-2 (VOC) لاختبار ت...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses at JoVE.com

الفيروسات الزائفة (PVs) هي فيروسات معيبة في النسخ المتماثل تستخدم لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف في ظل ظروف أكثر أمانا من التعامل مع الفيروسات الأصلية. يظهر هنا بروتوكول مفصل يوضح كيف يمكن استخدام SARS-CoV-2 PVs لاختبار قدرة مصل المرضى على التحييد بعد التطعيم ضد COVID-19.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

الفيروسات الزائفة هي أدوات جزيئية يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف واختبار النشاط المعادل لعينات المصل. في العمل الذي نقدمه اليوم ، سيتم تقديم منهجية عامة لإنتاج فيروسات من النمط الكاذب ، تعتمد على البلازميد الحر. بالنسبة لمقايسات التحييد ، تستخدم الفيروسات من النوع Y بشكل عام ، ولكنها شديدة الإمراض ولا يمكن التعامل معها في مختبرات BSL-2 ، مما يجعل هذا النظام قابلا للتطبيق على نطاق واسع.يمكن أن تكون تقنية الفيروسات الزائفة بديلا أكثر أمانا مقارنة بالفيروس الحي للسماح بدراسة العامل الممرض لتفاعل المضيف واختبار نشاط تحييد الأجسام المضادة. ستبحث التجارب المستقبلية في دور أجسام مضادة محددة في الحفاظ على المناعة بعد التطعيم باستخدام تقنية الفيروسات الزائفة.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

1.3K Views.  University of Verona. الفيروسات الزائفة هي أدوات جزيئية يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف واختبار النشاط المعادل لعينات المصل. في العمل الذي نقدمه اليوم ، سيتم تقديم منهجية عامة لإنتاج فيروسات من النمط الكاذب ، تعتمد على البلازميد الحر. بالنسبة لمقايسات التحييد ، تستخدم الفيروسات ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: دراسة تفاعلات الفيروس المضيف مع الفيروسات الزائفة 

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

To begin, in a six-well plate, seed one milliliter of human embryonic kidney 293T cells. Add two milliliters of complete DMEM. The next day, replace the medium with fresh antibiotic-free medium to prepare the cells for transfection.To transfect the adherent cells, first, prepare mix A by adding plasmid DNA to 100 microliters of Opti-MEM. Next, add 17.5 microliters of polyethylenimine to 100 microliters of Opti-MEM. Mix the contents of the mix A and B, then incubate.During incubation, gently flick the tube every three to four minutes to enhance mixing. Add the whole volume of the mixture to the plate with the HEK 293T cells. After 16 to 20 hours of transfection, replace the culture medium with fresh complete DMEM.Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide to produce the pseudotype viruses. After 72 hours of transfection, harvest the supernatant into a collection tube. Centrifuge the supernatant at 1, 600 G for seven minutes at room temperature.Then filter the supernatant through a 0.45 micrometer cellulose acetate filter. Distribute 50 microliters of complete DMEM in the wells of a 96-well plate. Leave row A empty.Add 100 microliters of the pseudovirus stock to the wells in row A.Next, pipette 50 microliters of the solution from row A to B.Repeat this process up to row G to obtain serial dilutions. Remove the exhausted medium from a plate with cultured susceptible HEK 293T ACE2 cells, and wash the cells with four milliliters of DPBS. Then detach the cells with one milliliter of trypsin EDTA in DPBS saline.Now add 50 microliters of the susceptible cell suspension into each well containing the pseudotype viruses. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for 48 hours. Add 100 microliters of the luciferase reagent to each well.After incubation, transfer the contents of each well into a black 96-well plate. Then read the plate in a plate reader. In a 96-well plate, add 50 microliters of fresh complete DMEM to columns one to 10 from rows B to H.Add 95 microliters of fresh complete DMEM to the corresponding wells of row A.Now add 50 microliters of complete DMEM to the wells in column 11 and 100 microliters of DMEM to column 12.Pipette five microliters of heat-inactivated serum samples to row A.With a multi-channel pipette, mix the samples in the first row and transfer 50 microliters of medium-containing serum from row A to B up to row H.Distribute 50 microliters of dilute pseudovirus containing medium to each well from columns one to 11. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for one hour. Prepare a suspension of susceptible HEK293T ACE2 cells in five milliliters.Add 50 microliters of the cell suspension to each well, then incubate before performing the luciferase assay. Lower serum dilution resulted in decreased viral entry into the cells. This is confirmed by the increased percentage of neutralization.