للبدء ، ماصة 3.75 ملليلتر من وسط المصل المختزل في أنبوب يسمى A وتخفيف الوسائط مع 105 ميكرولتر من كاشف النقل. دوامة محتويات الأنبوب لخلط جيدا. بعد ذلك ، أضف 3.75 ملليلتر من وسط المصل المختزل إلى أنبوب يسمى B.قم بتخفيف التعبير البلازميدات باستخدام 90 ميكرولترا من كاشف المحسن.
أضف الآن محتويات الأنبوب A إلى الأنبوب B وماصة المحلول لخلطه جيدا قبل الحضانة. قم بإزالة 10 ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا بعناية من لوحة Phoenix eco المعدة. ثم أضف الحجم الكامل لمزيج النقل إلى اللوحة بالتنقيط.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة. ضع وسط الحصاد الفيروسي MTCM في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لتسخينه مسبقا. الآن قم بإمالة لوحة Phoenix البيئية وماصة خارج وسط الثقافة.
بعد ذلك ، ماصة 30 ملليلتر من وسط الحصاد الفيروسي قبل التسخين ببطء في اللوحة المائلة. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة. بعد 48 ساعة من النقل ، احصد الطافي الفيروسي.
قم بتصفيته من خلال مرشحات PVDF 0.45 ميكرومتر. باستخدام الجزء الخلفي من حقنة معقمة ، سحق طحال الفئران المعزولة من خلال مصفاة خلية من 70 إلى 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ثم اغسل المصفاة بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لعزل الخلايا التائية.
بعد رفع الحجم النهائي للخلايا إلى 50 ملليلتر ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 غرام عند أربع درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية التي تحتوي على الخلايا الطحالية باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية الموصى بها.
ثم اعزل الخلايا التائية الإيجابية CD3 باستخدام الاختيار السلبي. انقل العزلة المنفصلة مغناطيسيا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. تحقق من عدد الخلايا مرة أخرى.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا التائية المعزولة لمدة 10 دقائق عند 450 جم عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط تنشيط MTCM. أضف الآن حبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة وإنترلوكين -2 إلى تعليق الخلية لتنشيط الخلايا التائية.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم صفر ، قم بطلاء ألواح معقمة غير معالجة من 24 بئرا مع 0.5 ملليلتر من كاشف محسن نقل الفبرونيكتين البشري. قم بتخزين الأطباق عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بإزالة كاشف النقل من الآبار. سد الآبار بحجم متساو من BSA المصفى المعقم المكمل ل PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة BSA PBS وغسل الآبار باستخدام 0.5 إلى واحد ملليلتر PBS.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من الفيروس القهقري الأنيق إلى كل بئر مطلي مسبقا. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2،000 غرام لمدة 90 دقيقة في 32 درجة مئوية. ثم أضف ملليلتر واحد من الخلايا التائية المنشطة إلى كل بئر محمل بشكل فيروسي.
أجهزة الطرد المركزي لوحات مرة أخرى في 450 G لمدة 10 دقائق في 32 درجة مئوية. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الخامس ، أعد تعليق الخلايا لفصل الخلايا التائية المنشطة عن الخرزات المغلفة بالأجسام المضادة.
ضع تعليق الخلية على مغناطيس لمدة 30 ثانية. ثم انقل التعليق إلى وعاء استزراع خارج الجسم الحي. ضع الأوعية في حاضنة عند 37 درجة مئوية قبل تحليل التدفق الخلوي.
أدى استخدام مجموعة عزل الخلايا التائية إلى نقاء الخلايا التائية بنسبة أقل من 98٪ قبل النقل. تم تحقيق معدلات تعبير CAR قابلة للتكرار من 65 إلى 75٪. أدت الثقافات خارج الجسم الحي مع interleukins-7 و 15 إلى 15 ضعفا في اليوم 10 بعد التنشيط من طحال واحد.
أدت زراعة الخلايا التائية مع الإنترلوكينات إلى ترددات خلايا تائية إيجابية CD8 و CD4 قابلة للمقارنة. بعد 10 أيام من الزراعة خارج الجسم الحي ، لوحظ الحفاظ على مجموعات ذاكرة الخلايا الجذعية.
