نشكر L. Brockmann على المراجعة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1R01EB030352 و UL1 TR001873.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (جامعة كولومبيا ، بروتوكولات AC-AABQ5551 و AC-AAAZ4470) باستخدام إناث BALB / c البالغة من العمر 6-8 أسابيع أو CF57BL / 6 الفئران التي يتراوح وزنها بين 20-25 جم. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتمحور هذا البروتوكول حول "أيام ما بعد التنشيط" للخلايا التائية الفئرانية ، ويبدأ الإنتاج الفيروسي في اليوم -2. يمكن تخزين الفيروس القهقري عند -80 درجة مئوية بعد الإنتاج الأولي ، وللاستخدام المستقبلي لهذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يبدأ بالخطوة 2 ، عزل الخلايا التائية وتنشيطها في اليوم 0.
1. إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية
ملاحظة: تم جعل المنتجات الفيروسية معيبة في النسخ المتماثل عن طريق فصل جينات التعبئة إلى بلازميدات منفصلة (انظر جدول المواد) ، مما يقلل بشكل كبير من احتمالية أحداث إعادة التركيب والإنتاج غير المقصود للفيروس المختص بالتكاثر.
<ol><li>تحضير خلايا Phoenix Eco قبل يوم واحد من النقل (إجراء اليوم -2).<ol><li>صفيحة حوالي 1 × 107 خلايا في صفيحة معالجة ب TC مقاس 15 سم أو دورق استزراع T150 ، باستخدام 30 مل من وسط الاستزراع (وسط استزراع Phoenix Eco ، كما هو مفصل في الجدول 1).</li>
		<li>احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد 18-24 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ تقريبا وموزعة بشكل موحد لضمان إنتاجية فيروسية عالية دون نمو زائد. ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، استخدم الخلايا ذات الممر المنخفض وقم بتمريرها في اليوم السابق للطلاء لإنتاج الفيروس. لا تسمح لخلايا Phoenix Eco بالنمو الزائد أثناء الزراعة الروتينية.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بإعداد مزيج النقل الذي يحتوي على الكواشف الشحمية والكاشفة المحسنة ، pCL-Eco (Gag / Pol) ، وبلازميد تعبير pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) في وسائط مصل مخفضة (انظر جدول المواد) (إجراء اليوم -1). ملاحظة: يجب إجراء النقل المشترك بنسبة 1: 1 من pMSCV و pCL-Eco.<ol><li>تحضير الأنبوب A: قم بتخفيف 105 ميكرولتر من كاشف النقل في 3.75 مل من وسط المصل المخفض لكل صفيحة 15 سم واخلطها جيدا عن طريق الدوامة أو السحب لأعلى ولأسفل.</li>
		<li>تحضير الأنبوب B: تمييع بلازميد تعبير pMSCV (21 ميكروغرام) و pCL-Eco (21 ميكروغرام) مع 90 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى 3.75 مل من وسط المصل المختزل لكل لوحة 15 سم. تخلط جيدا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل. ملاحظة: في حالة إنشاء منتجات فيروسية متعددة، قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على pCL-Eco وكاشف المحسن.</li>
		<li>أضف الأنبوب A إلى الأنبوب B واخلطه جيدا عن طريق الماصة. احتضان لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما ينتج عنه حجم إجمالي يبلغ حوالي 7.5 مل.</li>
		<li>قم بإزالة 10 مل من وسائط زراعة الخلايا بعناية من لوحة (لوحات) Phoenix Eco وأضف الحجم الكامل لمزيج النقل إلى الوسائط المتبقية عن طريق إمالة اللوحة والسحب بالتنقيط. أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتغيير الوسائط على خلايا Phoenix Eco المنقولة بعد 16-20 ساعة من النقل (إجراء اليوم 0).<ol><li>مصل ما قبل التسخين و β-mercaptoethanol (2-ME ، انظر جدول المواد) - وسط الخلايا التائية الخالية من الفئران (mTCM - الحصاد الفيروسي ، كما هو موضح في الجدول 1) إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي أو حبة.</li>
		<li>قم بإزالة وسط ثقافة Phoenix Eco بعناية عن طريق إمالة اللوحة ووضع طرف الماصة في الزاوية السفلية ، باستخدام مكنسة كهربائية إن أمكن. تجنب الإفراط في تجفيف الخلايا.</li>
		<li>أضف برفق وسط الحصاد الفيروسي mTCM الدافئ إلى جانب اللوحة المائلة عن طريق سحب 30 مل على أبطأ إعداد. أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن أن تتسبب هذه الخطوة في انفصال خلايا Phoenix Eco عن اللوحة وتقليل التتر الفيروسي. ستعمل الوسائط التي تم تسخينها مسبقا والسحب اللطيف على تقليل الاضطراب.</li>
	</ol></li>
	<li>حصاد طاف الفيروسية 48 ساعة بعد النقل (إجراء اليوم 1).<ol><li>احصد المادة الطافية الفيروسية وقم بتصفيتها من خلال مرشحات PVDF 0.45 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لإزالة الخلايا والحطام. قم بتجميد الفيروس عند -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى اليوم 1 من الخطوة 3 في حالة استخدام فيروس جديد.</li>
		<li>حدد العيار الفيروسي (وحدات التحويل / مل) عن طريق قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح سابقا9. هذه الخطوة اختيارية.<ol><li>تحديد العيار الفيروسي عن طريق نقل 1 × 105 خلايا تائية مورين منشطة على نطاق صغير في صفائح 96 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة (TC) ، مغلفة مسبقا بالريترونيكتين (انظر جدول المواد) ومحملة بتخفيفات تسلسلية ثلاثية من طاف الفيروس القهقري في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر من وسط الحصاد الفيروسي mTCM. ملاحظة: انظر الخطوة 2 والخطوة 3 أدناه للحصول على إرشادات مفصلة حول عزل الخلايا التائية وتنشيطها ونقلها.</li>
			<li>تحديد تعبير سطح CAR بعد 4-5 أيام من النقل عن طريق قياس التدفق الخلوي.</li>
			<li>احسب العيار الفيروسي وفقا للصيغة10: (N x F x D) / V ، حيث N هو عدد الخلايا المحولة ، F هو تردد الخلايا الموجبة CAR ، D هو عامل التخفيف ، و V هو حجم التنبيط في مل للحصول على وحدات تحويل (TU) / مل. ملاحظة: قد ينخفض العيار الفيروسي عند التجميد / الذوبان ؛ لذلك ، يتم تحديد العيار الفيروسي بشكل مثالي على الفيروس المجمد والمذاب لاحقا.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. عزل الخلايا التائية الفئران
<ol><li>عزل وتنشيط الخلايا التائية الفئران (إجراء اليوم 0). ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوات في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 4 درجات مئوية ويجب تنفيذها في بيئة معقمة.<ol><li>حصاد الطحال (الطحال) من سلالة الفئران ذات الأهمية (على سبيل المثال ، Balb / c ، C57BL / 6) كما هو موضح سابقا11 والحصول على تعليق أحادي الخلية من خلال التفكك الميكانيكي.</li>
		<li>باستخدام الجزء الخلفي من حقنة معقمة ، سحق الطحال (الطحال) من خلال مصفاة خلية 70-100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل.</li>
		<li>بعد وضع المحقنة جانبا ، اغسل المصفاة ب 5 مل من محلول عزل الخلايا التائية (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS ، مكمل بمصل بقري جنيني 2٪ ، FBS).</li>
		<li>كرر خطوة الهرس واغسل المصفاة مرة أخرى باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلايا التائية. ارفع الحجم النهائي إلى 50 مل باستخدام المخزن المؤقت لعزل الخلايا التائية.</li>
		<li>عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم اليدوي أو عداد الخلايا التلقائي عن طريق التخفيف بنسبة 1:20 ثم الخلط عند 1: 1 مع تريبان الأزرق.</li>
		<li>قم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 × جم ، عند 4 درجات مئوية (أو RT) ، وأعد تعليق الخلايا الطحالية عند 1 × 108 / مل في حالة استخدام مجموعة عزل الخلايا التائية الموصى بها (انظر جدول المواد). ملاحظة: يمكن إعادة تصفية الخلايا الطحالية من خلال مصفاة 40-70 ميكرومتر في هذه المرحلة لإزالة الكتل.</li>
	</ol></li>
	<li>اعزل خلايا CD3+ T عن طريق التحديد السلبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). بعد الفصل المغناطيسي ، انقل العزلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بإجراء تعداد نهائي للخلايا الحية.</li>
	<li>قم بتجميع الخلايا التائية المعزولة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 × جم ، عند 4 درجات مئوية (أو RT) ، وأعد تعليقها عند 1 × 106 / مل في وسط تنشيط mTCM (الجدول 1).</li>
	<li>قم بتنشيط الخلايا التائية عن طريق إضافة خرز مغناطيسي مغلف بالأجسام المضادة أحادية النسيلة مضادة ل CD3 / مضاد CD28 (انظر جدول المواد) بنسبة 25 ميكرولتر / 1 × 106 خلايا تائية و 100 وحدة / مل IL-2.</li>
	<li>ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية واتركها طوال الليل. ملاحظة: نظرا لصغر حجم الخلايا التائية ، يمكن تحقيق عدد أكثر دقة من الخلايا التائية الحية عن طريق التخفيف بنسبة 1: 10-1: 20 والخلط عند 1: 1 مع تريبان الأزرق للعد اليدوي باستخدام مقياس الدم. يمكن تحديد النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق تلطيخ الخلايا بجسم مضاد αCD3 مترافق بالفلورسنت. سينتج كل طحال ما بين 7-10 × 106 خلايا تائية اعتمادا على عمر وسلالة الفأر.</li>
</ol>3. نقل الخلايا التائية الفئران
<ol><li>تحضير لوحات للتنبيغ (إجراء اليوم 0).<ol><li>قم بطلاء الألواح المعقمة غير المعالجة مسبقا المكونة من 24 بئرا ب 0.5 مل من كاشف محسن نقل الفبرونيكتين البشري (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي يتراوح بين 20-40 ميكروغرام / مل عن طريق تخفيفه في برنامج تلفزيوني معقم وتخزينه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوة في اليوم 1 عن طريق طلاء الألواح غير المعالجة المكونة من 24 بئرا بكاشف التنبيغ واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء نقل الخلايا التائية (إجراء اليوم 1).<ol><li>تحضير لوحة المغلفة مسبقا للتنبيث. قم بإزالة كاشف النقل من كل بئر من الصفيحة والكتلة المطلية مسبقا المكونة من 24 بئرا بحجم مكافئ من PBS المصفى المعقم + 2٪ ألبومين مصل الأبقار (BSA) (0.5 مل) لمدة 30 دقيقة في RT.</li>
		<li>يغسل مرة واحدة مع 0.5-1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
	</ol></li>
	<li>أضف 0.5-1 مل من الفيروس القهقري الأنيق من الخطوة 1 أو مخفف بناء على العيار الفيروسي إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي مطلي مسبقا لمدة 90 دقيقة عند 2000 × جم و 32 درجة مئوية.</li>
	<li>أضف 1 مل من الخلايا التائية المنشطة إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي محمل بالفيروس لمدة 10 دقائق عند 450 × جم و 32 درجة مئوية. أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.</li>
	<li>بعد 24 ساعة من النقل ، قم بإزالة 1-1.5 مل من وسائط زراعة الخلايا واستبدلها ب 1-1.5 مل من mTCM-complete و 10 نانوغرام / مل من IL-7 و IL-15 البشري المؤتلف (انظر جدول المواد). أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية (إجراء اليوم 2). ملاحظة: أثناء الزراعة خارج الجسم الحي ، يجب إضافة 10 نانوغرام / مل من السيتوكينات إلى المزرعة كل 48 ساعة ، ويجب عدم تخفيف الخلايا التائية بعد 1 × 106 / مل.</li>
	<li>بعد 48 ساعة من النقل ، انقل الخلايا من لوحة التنبيغ إلى صفيحة جديدة من 24 بئرا أو 6 آبار وأعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية (إجراء اليوم 3). ملاحظة: قد تتحسن صلاحية الخلايا التائية عن طريق نقل الخلايا في 24 ساعة إلى يومين بعد النقل ، اعتمادا على بدء صلاحية الخلايا التائية والعيار الفيروسي.</li>
	<li>قم بإزالة خرزة الخلايا التائية وتأكيد تعبير CAR (إجراء اليوم 5-6).<ol><li>أعد تعليق الخلايا تماما لفصل الخلايا التائية المنشطة عن الخرزات المطلية ب αCD3 / CD28 (انظر جدول المواد) وضع تعليق الخلية على مغناطيس لمدة 30 ثانية. انقل معلق الخلية إلى وعاء الاستزراع خارج الجسم الحي المطلوب وأعده إلى حاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن استزراع الخلايا التائية في قوارير الثقافة أو ألواح زراعة الآبار العميقة. يوصى بطلاء ما لا يقل عن 5 × 106 خلايا T في 30 مل من وسط mTCM الكامل لكل بئر في بئر عميق من صفيحة ذات تنسيق 6 آبار (انظر جدول المواد).</li>
		<li>تحديد تعبير CAR عن طريق قياس التدفق الخلوي8. ملاحظة: تم تحديد تعبير GFP-CAR عن طريق الحضانة مع 100 نانوغرام / مل من GFP المنقى. سيؤدي دمج علامة N-terminal epitope إلى تسهيل اكتشاف تركيبات CAR البديلة.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء زراعة خارج الجسم الحي للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية (إجراء اليوم 7-10).<ol><li>أثناء الزراعة خارج الجسم الحي ، حافظ على الخلايا عن طريق إزالة 50٪ من وسط المزرعة واستبداله ب mTCM-complete + 2x 10 نانوغرام / مل من IL-7 و IL-15 كل 48 ساعة. ملاحظة: خلايا Murine CAR-T جاهزة للاستخدام في التطبيقات النهائية بعد 7 أيام من التنشيط ويجب عدم حفظها بالتبريد بسبب ضعف الصلاحية بعد الذوبان.</li>
	</ol></li>
</ol>

بروتوكول مبسط لتوليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في النماذج المتزامنة

<ol>
	<li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy.">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li><li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies.">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li><li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment.">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li><li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine.">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).</li><li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression.">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li><li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+new+roads+for+cars.">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li><li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade.">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li><li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression.">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).</li><li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus.">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li><li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells.">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299 (2021).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.">Lab Animal Research.</a> Sterile Tissue Harvest. , (2023).</li><li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy.">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li><li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response.">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li><li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers.">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li><li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function.">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li><li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy:+Challenges+and+ways+forward.">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702 (2020).</li><li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy.">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li><li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics.">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li><li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells.">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).</li><li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8++T+lymphocytes.">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li></ol>

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يصف هذا البروتوكول الخطوات والكواشف اللازمة لنقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية الفئرانية لتوليد خلايا CAR-T للدراسات في الجسم الحي . إن تحسين ظروف نقل الفيروسات القهقرية يحقق تعبيرا قويا عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق أو الكواشف الإضافية. ومع ذلك ، ...

أحدثت علاجات الخلايا التائية بالتبني التي تعبر عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CARs) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسخير قوة جهاز المناعة التكيفي لاستهداف الخلايا السرطانية الإيجابية للمستضد والقضاء عليها على وجه التحديد1. في حين تم التحقق سريريا من صحة نجاح علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف الأورام الخبيثة في الخلايا البائية ، تظل الدراسات قبل السريرية التي أجريت على النماذج الحيوانية حيوية لتطوير مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة التي تستهدف الأورام الصلبة. ومع ذلك ، فقد تم إثبات فعالية سريرية محدودة في مؤشرات الورم الصلب حتى الآن ، وأصبح من الواضح بشكل متزايد أن النماذج الفردية قبل السريرية لا تتنبأ بدقة بالديناميكا الدوائية والفعالية السريرية للدواءالحي 2,3. لذلك ، بدأ الباحثون في توسيع الدراسة قبل السريرية لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لتشمل تقييمات موازية في النماذج الغريبة والنماذج الجينية لسرطانات الإنسان والفئران ، على التوالي.
على عكس نماذج الطعم الأجنبي ، حيث يتم غرس الأورام البشرية والخلايا التائية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فإن النماذج الجينية تمكن من فحص استجابات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في سياق نظام المناعة الوظيفي. على وجه التحديد ، توفر الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تحمل أوراما متزامنة نظاما لدراسة التفاعل بين الخلايا التائية المنقولة بالتبني والأوساط الخاصة بالسياق - بما في ذلك الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) المعروفة بقمع وظيفة الخلايا التائية في البيئة المكروية للورم (TME)4،5،6. علاوة على ذلك ، توفر النماذج الجينية منصة إضافية لتقييم السمية المستهدفة خارج الورم ، وتفاعل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية مع العوامل المضيفة التي قد تؤدي إلى سمية إضافية ، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين7.
على الرغم من هذه المزايا ، لا يزال عدد دراسات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الاصطناعية محدودا. والجدير بالذكر أن النماذج التخليقية تتطلب هندسة ذاتية لخلايا CAR-T من نفس سلالة الفأر ، وبالتالي تمثل تحديا إضافيا بسبب عدم وجود منهجية لنقل الخلايا التائية الفعالة للفأر والتوسع خارج الجسم الحي 2,8. يحدد هذا البروتوكول طرق تحقيق تعبير مستقر عن CAR من خلال إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية ونقل الخلايا التائية الأمثل. يظهر رسم تخطيطي للعملية بأكملها في الشكل 1. يوضح استخدام هذا النهج النقل الفعال للفيروسات القهقرية للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وتحقيق تعبير عالي عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق. تتم مناقشة استراتيجيات تغيير خصوصية المستضد لبناء CAR بالإضافة إلى التعبير المشترك عن جينات التحوير الإضافية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm TC treated cell culture dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>130183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C, 6-8 week old&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-321-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet&#160;</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse T cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex6</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>80240M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-15&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-453-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD4 BV605</td>
			<td>BD</td>
			<td>563151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD44 APC&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD62L PE-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 60-0621-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD8 APC-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 25-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2 with Prime 95B camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31-985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Eco cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG.2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV_PGK_GFP28z</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified sfGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (&#39;transduction reagent&#39;)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of murine chimeric antigen receptor (car)-t cells

حققت العلاجات الخلوية المهندسة باستخدام مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -T فعالية ملحوظة في الأفراد المصابين بالأورام الخبيثة الدموية وتخضع حاليا للتطوير لعلاج الأورام الصلبة المتنوعة. حتى الآن ، تم إجراء التقييم الأولي لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة في الغالب في نماذج ورم xenograft باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تم اختيار هذا النهج لتسهيل التطعيمات الناجحة للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية البشرية في البيئة التجريبية. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران التخليقية ، التي تستمد فيها الأورام والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من نفس سلالة الفأر ، تسمح بتقييم تقنيات CAR الجديدة في سياق نظام المناعة الوظيفي والبيئة المكروية الشاملة للورم (TME). يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى تبسيط عملية توليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في الفأر من خلال تقديم طرق موحدة لنقل الفيروسات القهقرية وزراعة الخلايا التائية خارج الجسم الحي . يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك المستخدمة في هذه الدراسة لتمكين التقييم الروتيني لتقنيات CAR الجديدة في الأنظمة ذات الكفاءة المناعية.

Adoptive T cell therapies expressing chimeric antigen receptors (CARs) have revolutionized the field of cancer immunotherapy by harnessing the power of the adaptive immune system to specifically target and eliminate antigen-positive cancer cells1. While the success of CAR-T cell therapies targeting B cell malignancies has been clinically validated, preclinical studies performed in animal models remain vital for the development of new CARs targeting solid tumors. However, limited clinical efficacy has been demonstrated in solid tumor indications thus far, and it is becoming increasingly apparent that individual preclinical models do not accurately predict the pharmacodynamics and clinical efficacy of a living medicine2,3. Therefore, investigators have begun to expand the preclinical study of CAR-T cell products to include parallel assessments in xenograft and syngeneic models of human and murine cancers, respectively.
Unlike xenograft models, where human tumors and T cells are engrafted into immunodeficient mice, syngeneic models enable the examination of CAR-T cell responses in the context of a functional immune system. Specifically, immune-competent mice bearing syngeneic tumors provide a system to study the interaction between adoptively transferred T cells and context-specific milieus - including tumor-associated macrophages (TAMs) and regulatory T cells (Tregs) known to suppress T cell function in the tumor microenvironment (TME)4,5,6. Moreover, syngeneic models offer an additional platform to assess on-target, off-tumor toxicity, and CAR-T cell interaction with host factors that may lead to additional toxicities, including cytokine release syndrome7.
Despite these advantages, the number of syngeneic CAR-T cell studies remains limited. Notably, syngeneic models require autologous engineering of CAR-T cells from the same mouse strain and thus present an additional challenge due to the lack of methodology for efficient murine T cell transduction and ex vivo expansion2,8. This protocol outlines the methods to achieve stable CAR expression through the production of retroviral vectors and optimized T cell transduction. A schematic of the entire process is shown in Figure 1. The use of this approach demonstrates efficient retroviral transduction of murine CAR-T cells and the achievement of high CAR expression without the need for viral concentration through ultracentrifugation. Strategies to change the antigen-specificity of the CAR construct are discussed in addition to the co-expression of additional transgenes.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز وظيفة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في نماذج الورم الجيني 

التوليد الفعال لمستقبلات مستضد الفئران الخيمري (CAR) - الخلايا التائية

Our research explores effective combinations of engineered bacteria and CAR T-cells for solid tumor treatment. It's important for us to study how these two cell therapies function within the context of a complete immune system using syngeneic models of ovarian cancer. Studying the function of CAR T-cells in syngeneic tumor models has been limited by the lack of standardized protocols for generating murine CAR T-cells.Murine T-cells are particularly difficult to transduce in culture ex vivo using traditional methods. We developed this protocol to streamline the production of murine CAR T-cells to enable study in syngeneic models that provide important context to evaluate the activity of new CAR technologies.

يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى توحيد عملية نقل الخلايا التائية للفأر لتوليد خلايا CAR-T للفأر. ويقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للخطوات المعنية. تبدأ العملية بإنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية عن طريق النقل المشترك للمكونات الفيروسية إلى خلايا Phoenix Eco. يقدم الشكل 2</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing CAR-T Cell Function in Syngeneic Tumor Models at JoVE.com

يبسط هذا البروتوكول إنتاج النواقل الفيروسية القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر ، مما يسهل التوليد الفعال للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للفئران.

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

يستكشف بحثنا مجموعات فعالة من البكتيريا المهندسة والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية لعلاج الأورام الصلبة. من المهم بالنسبة لنا أن ندرس كيفية عمل هذين العلاجين الخلويين في سياق جهاز مناعي كامل باستخدام نماذج جينية لسرطان المبيض. كانت دراسة وظيفة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في نماذج الورم التخليقي محدودة بسبب عدم وجود بروتوكولات موحدة لتوليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية الفئرانية.يصعب بشكل خاص تحويل الخلايا التائية للفأر في الثقافة خارج الجسم الحي باستخدام الطرق التقليدية. لقد طورنا هذا البروتوكول لتبسيط إنتاج الخلايا التائية CAR T لتمكين الدراسة في النماذج الجينية التي توفر سياقا مهما لتقييم نشاط تقنيات CAR الجديدة.

efficient-generation-of-murine-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

2.3K Views.  Columbia University. يستكشف بحثنا مجموعات فعالة من البكتيريا المهندسة والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية لعلاج الأورام الصلبة. من المهم بالنسبة لنا أن ندرس كيفية عمل هذين العلاجين الخلويين في سياق جهاز مناعي كامل باستخدام نماذج جينية لسرطان المبيض. كانت دراسة وظيفة الخلايا الت...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز وظيفة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في نماذج الورم الجيني 

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.