Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

لأداء الطلاء العضوي ، أولا ، قم بإزالة المادة الطافية من أجهزة الطرد المركزي وخلايا سرطان الخلايا الكبدية المغسولة. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولترا من مستخلص الغشاء القاعدي ، أو BME ، لكل بئر ، للطلاء. بعد ذلك ، قم بتعليق الخلايا في DMEM / F12 المتقدم.

ثم ماصة بلطف تتجمع الخلية حتى يتم رؤية تعليق متساوي. أضف BME إلى التعليق ، مع التأكد من أن تركيز BME يتراوح بين 30 و 50٪ الآن بذر 50 ميكرولتر من قطرات BME مع مجموعات الخلايا في وسط صفيحة بئر 24. اترك القطرات تتجمد عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

أضف 500 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا إلى كل بئر واحتضانه في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية. قم بتحديث وسيط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام. بعد أسبوعين ، استبدل وسط العزل بوسط التمدد العضوي.

بعد سبعة إلى 10 أيام من الزراعة ، بمجرد وصول الكائنات العضوية إلى الكثافة المناسبة ، قم بمعالجة الثقافات حسب الحاجة. لتمرير المواد العضوية ، قم أولا بتسخين ألواح زراعة الخلايا السطحية منخفضة التعلق للغاية في حاضنة. بعد ذلك ، قم بإذابة BME المجمد طوال الليل عند أربع درجات مئوية حتى قبل الاستخدام مباشرة.

سخن محلول الحصاد العضوي وبديل التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد مرحلة التحضير ، قم بإزالة وسط الاستزراع من لوحة الاستزراع العضوي. ثم نقل تعليق عضوي إلى أنبوب 15 ملليلتر.

أضف الآن محلول حصاد عضوي بما يتناسب مع كمية BME. لخلط التعليق ، استخدم مسدس ماصة سعة 1000 ميكرولتر لكشط وماصة لأعلى ولأسفل. بعد احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، استخدم ماصة واحدة ملليلتر لشفط BME بعناية.

تأكد من حل BME بالكامل. راقب المستخلص كل 10 دقائق حتى تظهر مجموعة خلايا عضوية واضحة. ثم أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 400 غرام لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية. لبدء الهضم الأنزيمي لعضويات سرطان الخلايا الكبدية ، أضف واحدا إلى خمسة ملليلتر من بديل التربسين المسخن مسبقا إلى الحبيبات العضوية المستزرعة. احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

استخدم المجهر للتحقق مما إذا كانت الكائنات العضوية تتفكك إلى مجموعات صغيرة من خليتين إلى 10 خلايا. لإيقاف الهضم ، أضف حجما مناسبا من الوسط القاعدي البارد. ثم أجهزة الطرد المركزي المواد العضوية في 400 غرام لمدة خمس دقائق عند ثماني درجات مئوية.

إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من الطاف. أعد تعليق العدد المطلوب من المواد العضوية في المصفوفة المناسبة للطلاء. كل 10 أيام تمر المواد العضوية ، وهذا يتوقف على كثافة نمو العضوية.

لوحظت كرويات عضويات HCC في غضون ثلاثة أيام من الثقافة. شوهدت كرويات مدمجة ذات حواف مستديرة وسيتوسول نافذ في اليوم الأول من التأسيس. كانت المواد العضوية متشابهة الحجم وكان قطرها الأكبر عند استزراعها في 30 إلى 50٪ BME.

كان BME أكثر تجزؤا بنسبة 10٪ مما أدى إلى أصغر المواد العضوية. كان BME سليما بنسبة 100٪ ولكنه أدى إلى عضويات ذات قطر متوسط. بلغ حجم العضو العضوي HCC المتكاثر حجما يتجاوز 500 ميكرومتر في كل ثقافة بعد ثلاثة أجيال.

تم الحصول على عضويات HCC كبيرة الحجم أعلى من 1000 ميكرومتر خلال فترة استزراع مدتها 20 يوما.