CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing

للبدء ، حصاد PBMCs المعالجة بالمخدرات عن طريق الطرد المركزي وجمع تحلل الخلية في لوحة PCR. أجهزة الطرد المركزي لوحة لجمع المحللة في القاع. بعد ذلك ، قم بإجراء تمسخ mRNA باستخدام جهاز تدوير حراري.

ثم أضف ستة ميكرولترات من مزيج تفاعل النسخ العكسي إلى كل بئر لتحقيق حجم إجمالي قدره 12 ميكرولتر. أغلق اللوحة للحماية من التلوث ولمنع التبخر. أجهزة الطرد المركزي لوحة بعد دوامة لفترة وجيزة.

ضع اللوحة على جهاز التدوير الحراري وابدأ برنامج تفاعل النسخ العكسي. بعد النسخ العكسي ، قم بطرد لوحة PCR ، أضف 15 ميكرولترا من مزيج التضخيم المسبق في كل بئر وأغلقه. ضع اللوحة المختومة على جهاز التدوير الحراري وابدأ تفاعل التضخيم المسبق.

لتنظيف cDNA ، أضف حبات تنقية مغناطيسية إلى كل بئر واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع لوحة PCR على رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق أو حتى تنفصل الخرزات. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية.

مع الحفاظ على اللوحة على الرف المغناطيسي ، أدخل بلطف 100 ميكرولتر من الإيثانول الطازج 80٪ لتنظيف الخرز. بعد حضانة مدتها 30 ثانية ، استخدم ماصة للتخلص من المادة الطافية. اترك الخرزات تجف في الهواء على الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق أو حتى يتبخر الإيثانول تماما ولا تبدو الخرزات لامعة.

بعد إزالة اللوحة من الرف المغناطيسي ، أعد تعليق الخرزات في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. أعد وضع اللوحة على الرف المغناطيسي حتى يتم فصل الخرز. انقل الشطف إلى لوحة PCR جديدة معدة لمراقبة جودة cDNA ووضع العلامات عليها.

لوضع العلامات ، أضف ثلاثة ميكرولترات من مزيج العلامات لكل تفاعل على لوحة PCR جديدة. أضف ميكرولترا واحدا من cDNA إلى كل تفاعل. ابدأ تفاعل وضع العلامات على الفور.

ثم قم بتحييد التفاعل عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت للعلامات المحايدة لكل تفاعل. لتخصيب PCR ، أضف تسعة ميكرولترات من مزيج PCR للتخصيب في كل تفاعل لتحقيق حجم إجمالي قدره 14 ميكرولتر. بدء برنامج PCR الإثرائي.