Isolating Single Cells from Upper Endoscopy Biopsies Derived from Gastric Patients for Organoid Generation

لبدء عزل الخلايا المفردة من خزعات المعدة التي تم جمعها أثناء التنظير العلوي للمريض ، أولا ، اسمح للأنسجة بالاستقرار في قاع أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. بمجرد الاستقرار ، استخدم ماصة لشفط الوسائط وغسل الخزعات مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مكمل بالمضادات الحيوية. نقل ما لا يقل عن 20 ملليغرام من الأنسجة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من PBS المكمل ب DTT.

استخدم مقص تشريح دقيق لتقطيع الأنسجة إلى قطع يتراوح طولها من ملليمتر إلى ملليمترين أو أصغر. استخدم جهاز طرد مركزي صغير منضدية لمدة 15 ثانية لتجميع قطع الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب ، ثم استنشاق أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. أضف خمسة ملليلتر من محلول الهضم الدافئ حديثا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.

انقل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت من هذا الأنبوب إلى الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على قطع الأنسجة. بعد ذلك ، باستخدام المقص ، قم بقص طرف ماصة 1،000 ميكرولتر من الأسفل لزيادة قطر الطرف لتقليل فقد الأنسجة. الآن ، باستخدام طرف الماصة المعدل ، انقل قطع الأنسجة الصغيرة من الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر إلى مخزن الهضم في الأنبوب سعة 50 ملليلتر.

احتضان مخزن الهضم ومزيج الأنسجة عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز الحجاج عند 200 دورة في الدقيقة. ثم أضف خمسة ملليلتر من التربسين الدافئ مع 0.25٪ EDTA إلى الأنسجة الموجودة في محلول الهضم واحتضانها. تحييد المخزن المؤقت للهضم والتربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط DMEM / F-12 المتقدم وتمرير التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون.