تلطيخ التألق المناعي والفحص المجهري عالي الدقة متحد البؤر لخلايا هيلا القاضية CRISPR / Cas9 بوساطة CENP-E

للبدء ، خذ طبقا من النوع البري وخلايا HeLa الطافرة CENP-E التي تنمو على زلة الغطاء. ثبت الخلايا بمحلول مثبت 4٪ بارافورمالدهيد و PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، انغمس في برنامج تلفزيوني لمدة جولتين مدة كل منهما خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتخلل الخلايا بنسبة 0.25٪ Triton X-100 و PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغمرهم في برنامج تلفزيوني لمدة جولتين مدة كل منهما خمس دقائق. تابع حظر الخلايا باستخدام 1٪ BSA PBS مع 0.1٪ Tween 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

تمييع الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA و PBST واحتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة. تخلص من محاليل الأجسام المضادة الأولية. ثم ، شطف الخلايا ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع برنامج تلفزيوني.

أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى الخلية واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، تجاهل الأجسام المضادة الثانوية. ثم شطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما.

تلطيخ النوى باستخدام DAPI في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط التثبيت وختمها بطلاء الأظافر. راقب الصور الفلورية باستخدام مجهر المسح متحد البؤر ، مزود بتكبير 63 مرة ، وهدف فتحة عددية 1.40 ، وسجلها لمزيد من التحليل.

أظهر تلطيخ التألق المناعي للمجموعات الضابطة ومجموعات CENP-E الطافرة أن شدة التألق لبروتينات CENP-E قد تم التخلص منها تماما في خلايا Clone 1 الطافرة CENP-E وانخفضت بشكل ملحوظ في خلايا CENP-E الطافرة Clone 3. زادت نسب خلايا الطور الاستوائي مع اختلال الكروموسوم في Clones 1 و 3 مقارنة بالخلايا الضابطة. وفي الوقت نفسه ، زادت نسب خلايا الطور الاستوائي بشكل ملحوظ في خلايا Clone 1 وخلايا Clone 3.

بالإضافة إلى ذلك ، زادت نسبة خلايا الطور البيني بشكل طفيف في مجموعات Clone 1 و 3 بعد حذف CENP-E ، مقارنة بالمجموعة الضابطة. انخفضت معدلات خلايا الطور الأولي والطور الانفصالي والطور النهائي بشكل طفيف بعد حذف CENP-E ، في حين زادت معدلات خلايا الطور الاستوائي بعد حذف CENP-E.