تحضير الكروموسوم وتحليل النمط النووي لخلايا هيلا الضربة القاضية CRISPR / Cas9 بوساطة CENP-E

للبدء ، خذ النوع البري ومزارع خلايا HeLa الطافرة CENP-E وأضف 300 كولشيسين نانولار قبل حضنها لمدة خمس ساعات. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، وجمع الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا عند 1000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المواد الطافية وأضف 1.2 ملليلتر من محلول كلوريد البوتاسيوم المولي 0.075.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بطرد الخلايا ، وتجاهل المادة الطافية ، وإضافة 0.2 ملليلتر من المحلول المثبت للبادئة. امزج بلطف لمدة دقيقة واحدة ، ثم اجمع كريات الخلية كما هو موضح سابقا ، وأضف 1.5 ملليلتر من المحلول المثبت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي للخلايا والتخلص من المادة الطافية ، أضف 0.6 ملليلتر من المحاليل المثبتة لإنشاء تعليق خلوي. قم بإسقاط ثلاث إلى خمس قطرات من تعليق الخلية بعناية من 35 إلى 40 سم على الشرائح الجليدية. جفف الشرائح على الفور باستخدام مصباح كحولي وقم بتلطيخها بمحلول Giemsa المستدام بنسبة 10٪ لمدة سبع دقائق.

شطف الشرائح بالماء الجاري لمدة دقيقتين ، ثم فحص العينات باستخدام مجهر ضوئي مزود بخطة فلور 40 مرة تكبير 0.75 فتحة عددية موضوعية. كشف تحليل النمط النووي عن انخفاض أعداد الكروموسومات في خلايا هيلا الطافرة CENP-E مقارنة بخلايا النوع البري.