للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت 2X ل RT-qPCR في الماء الخالي من DNase / RNase. قم بتخزين المخزن المؤقت عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بخلط الاشعال والمجسات في أنبوب 1.5 ملليلتر.
قم بتكوين الحجم باستخدام المخزن المؤقت للشطف. ثم قم بتخزين الأنبوب عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. تحضير مزيج إنزيم مع Taq polymerase و M-MLV RT في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد.
قم بتكوين الحجم باستخدام المخزن المؤقت لتخزين Taq polymerase. الآن أعد تعليق الحمض النووي الريبي الاصطناعي الفيروسي في أنابيب منفصلة مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA لعمل مخزون من 10 إلى نسخ الحمض النووي الريبي السادسة لكل ميكرولتر. لخلط مخزون الفيروس ، أضف خمسة ميكرولترات لكل من أنفلونزا SARS-CoV-2 A و B إلى 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت Tris-EDTA.
وبالمثل ، امزج SARS-CoV-2 و MERS-CoV للحصول على مزيج فيروسي ثان. تمييع كلا الخليطين عشرة أضعاف للحصول على تخفيف نهائي من 10 نسخ الحمض النووي الريبي لكل ميكرولتر. لكل بئر من صفيحة 96 بئرا ، ماصة 2X عازلة ، التمهيدي ، إنزيم ، المياه الخالية من DNase / RNase ، ومخاليط الحمض النووي الريبي المقابلة.
ختم اللوحة بختم لوحة لاصقة. ثم أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة دقيقة واحدة لجمع السائل في قاع البئر. بعد ذلك ، قم ببرمجة آلة PCR لقبول نوع الكتلة السريع المكون من 96 بئرا مع ضبط النوع التجريبي على المنحنى القياسي.
اضبط الكواشف على كواشف TaqMan وحدد خصائص التشغيل القياسية. حدد أهداف الجينات وصبغة المراسل. ثم حدد أسماء العينات لكل تفاعل ليتم اختباره وقم بتعيين الأهداف والعينات لتخطيط اللوحة.
الآن ، أدخل برنامج الدورة في الأداة. انقل اللوحة إلى آلة qPCR في الوقت الفعلي في الاتجاه الصحيح واضغط على تشغيل لبدء الدورة. اختر موقع الملف لحفظ البيانات التجريبية.
ثم افحص مخططات التضخيم التي يوفرها برنامج qPCR. تمكنت المجموعتان المطورتان من تضخيم جميع الجينات المستهدفة الثلاثة بنجاح في وقت واحد مع انخفاض يصل إلى 10 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل تفاعل. كانت كفاءات التضخيم لجميع عمليات المعايرة الفيروسية أعلى من 99٪
