تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV

الهدف العام من هذا الاختبار هو إدارة نهج متعدد الإرسال للكشف المتزامن عن فيروسات الجهاز التنفسي المنتشرة بشكل شائع مثل SARS-CoV-2 و MERS و الإنفلونزا A و Influenza B ، وتشمل التقنيات السائدة التي تقود التقدم في مجالنا CRISPR ، ومقايسات التدفق الأميني الجانبي ، وأجهزة الاستشعار الجزيئية الحيوية الورقية ، واختبار شيرلوك في وعاء واحد ، وأبستامير الحمض النووي ، و RT-qPCR متعدد الإرسال المتكامل مع التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة ، مصباح. ومع ذلك ، فإن RT-qPCR متعدد الإرسال هو الأكثر حساسية وشيوعا وهو المعيار الذهبي لتشخيص الفيروسات المختلفة. يتمثل التحدي التجريبي الحالي في إنشاء بروتوكول يمكن استخدامه للكشف عن نسخ الحمض النووي الريبي التي تصل إلى 10 نسخ.

استخدمنا مجموعة RT-qPCR الداخلية للفحص ، وهي فعالة من حيث الوقت والتكلفة. للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت 2x ل RT-qPCR في المياه الخالية من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي قم بتخزين المخزن المؤقت عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الآخر. بعد ذلك ، امزج الاشعال والمجسات في أنبوب سعة 1.5 مل.

قم بتكوين الحجم باستخدام محلول الشطف ، ثم قم بتخزين الأنبوب عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد مزيج إنزيم مع بوليميراز taq و MMLV-RT في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج. قم بتكوين الحجم باستخدام مخزن تخزين بوليميراز taq.

الآن قم بإعادة تعليق الحمض النووي الريبي الاصطناعي الفيروسي في أنابيب منفصلة مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA لعمل مخزون من 10 إلى سادس نسخ من الحمض النووي الريبي لكل ميكرولتر. لخلط مخزونات الفيروس ، أضف خمسة ميكرولترات لكل من SARS-CoV-2 والإنفلونزا A و B إلى 50 ميكرولترا من محلول Tris-EDTA. وبالمثل ، امزج SARS-CoV-2 و MERS-CoV للحصول على مزيج فيروسي ثان.

قم بتخفيف كلا الخليطين عشرة أضعاف للحصول على تخفيف نهائي بمقدار 10 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل ميكرولتر. لكل بئر من صفيحة 96 بئر ، ماصة 2x عازلة ، برايمر ، إنزيم ، ماء خال من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، ومخاليط الحمض النووي الريبي المقابلة. أغلق اللوحة بختم لوحة لاصقة.

ثم قم بالطرد المركزي للوحة لمدة دقيقة واحدة لتجميع السائل في قاع البئر. بعد ذلك ، قم ببرمجة جهاز PCR لقبول نوع كتلة البئر 96 السريع مع ضبط النوع التجريبي على المنحنى القياسي. قم بتعيين الكواشف إلى كواشف TaqMan وحدد خصائص التشغيل القياسية.

تحديد أهداف الجينات وصبغة المراسل. ثم حدد أسماء العينات لكل تفاعل ليتم اختباره وتعيين الأهداف والعينات لتخطيط اللوحة. الآن أدخل برنامج الدورة في الأداة.

انقل اللوحة إلى جهاز QPCR في الوقت الفعلي في الاتجاه الصحيح واضغط على تشغيل لبدء الدورة. اختر موقع الملف لحفظ البيانات التجريبية. ثم فحص مخططات التضخيم التي يوفرها برنامج QPCR.

تمكنت المجموعتان المطورتان من تضخيم جميع الجينات المستهدفة الثلاثة بنجاح في وقت واحد ، مع انخفاض يصل إلى 10 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل تفاعل. كانت كفاءات التضخيم لجميع أجهزة المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسية أعلى من 99٪